吳麗萍, 蘇興隆, 曹夢(mèng)陽(yáng), 王兆健, 邢世海,2*

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012；2. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所，合肥 230012)

丹參(Salvia miltiorrhiza)為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬多年生直立草本植物，藥用部分為干燥根和根莖，為我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥材[1]。丹參主產(chǎn)于安徽、四川、山西、江蘇、河北等地，其性微寒、味苦、歸心、肝經(jīng)，是治療心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥材[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有保護(hù)心血管系統(tǒng)[3]、防止動(dòng)脈粥樣硬化[4]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[5]、改善微循環(huán)[6]和抗炎抗菌[7]等多種藥理作用，臨床常用于心腦血管疾病、癌癥、糖尿病和肝病等的治療[8-10]。現(xiàn)代化學(xué)分析表明丹參的化學(xué)成分以脂溶性二萜丹參酮類(lèi)和水溶性丹酚酸類(lèi)為主，還有多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、甾體類(lèi)等成分[11-12]；近年來(lái)還報(bào)道丹參中含有生物堿成分[13]。目前對(duì)丹參的研究大多集中在丹參酮和丹酚酸上，其生物合成途徑大部分已被解析[14-15]；而關(guān)于丹參生物堿的研究甚少，尚無(wú)其合成途徑的報(bào)道。在生物堿中，萜類(lèi)吲哚生物堿是一類(lèi)非常重要的具有萜環(huán)和吲哚骨架的生物堿化合物，具有顯著的藥理學(xué)活性，臨床主要用于抗癌、抗心律失常和抗瘧疾等[16]。

單萜吲哚類(lèi)生物堿阿嗎靈，其合成路徑已比較透徹[17]，其中Vinorine 合成酶(vinorine synthase, VS)是阿嗎靈合成途徑中的1 個(gè)關(guān)鍵酶，催化蛇根精型生物堿16-epi-vellosimine 可逆性地合成阿嗎靈型生物堿Vinorine，Vinorine 合成酶連接2 種不同類(lèi)型的生物堿，即蛇根精型(Sarpagan)和阿嗎靈型生物堿(Ajmalan)[17]。Vinorine 合成酶是第一個(gè)三維結(jié)構(gòu)被解析的酰基輔酶A 依賴(lài)型?；D(zhuǎn)移酶(BAHD)家族成員，BAHD 得名于從植物中分離出的前4 種家族酶，該家族成員在多種次生代謝產(chǎn)物的生物合成中起著重要作用[18-19]，但目前在丹參中尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從丹參中克隆SmVS基因，對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)(RT-qPCR)檢測(cè)SmVS基因的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究其功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

材料采自安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥園，生長(zhǎng)光/暗周期為16 h/8 h，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為唇形科丹參(Salvia miltiorrhiza)。采集丹參后用自來(lái)水清洗表面雜質(zhì)，置于冰盒中轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，用蒸餾水沖洗3 次，吸干水分立即用液氮冷凍提取總RNA。

1.2 總RNA 提取和cDNA 的合成

采用改良的TRIzol 法[20]提取丹參根和葉的總RNA，使用FastQuant RT Kit (Tiangen Biotech，北京)試劑盒合成cDNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR 擴(kuò)增

根據(jù)丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[21]，查找與SmVS同源的cDNA 序列用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行特異PCR 擴(kuò)增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 生物信息學(xué)分析

根據(jù)PCR 擴(kuò)增得到的基因全長(zhǎng)序列，利用ORF Finder 網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)尋找開(kāi)放閱讀框(ORF)，并翻譯出氨基酸序列；在線(xiàn)進(jìn)行序列同源性比對(duì)(http://blast.Ncbi.Nlm.Nih.gov),并進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析(http://web.expasy.org/protparam); 用TMHMM 在線(xiàn)程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)分析蛋白質(zhì)的可能跨膜區(qū)；利用PSORT 軟件(https://www.genscript.com/psort.html)預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位；利用GOR4 軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測(cè)蛋白的二維結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL 軟件(https://swiss model.expasy.org/)進(jìn)行編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；并利用MEGA X 軟件(Neighbor-joining，鄰位相連法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 SmVS 基因表達(dá)的RT-qPCR 分析

采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑(TaKaRa)和Roche Z480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，以GAPDH作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)定量引物SmVS-RT (表1)，參照韓榮春等[22]的方法進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，比較SmVS基因在葉和根中的表達(dá)差異，并分析其在葉中表達(dá)的日變化規(guī)律(n=3)。

2 結(jié)果和分析

2.1 SmVS 基因的克隆

采用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，取5μL 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明克隆得到的條帶與轉(zhuǎn)錄組預(yù)期基因片段大小一致(圖1)。將其核苷酸序列(圖2)與其他植物VS基因進(jìn)行比對(duì)，表明該基因與其他植物的同源基因具有很高相似性，因此命名為SmVS?；蛉L(zhǎng)為726 bp，編碼241 個(gè)氨基酸(圖2)。該基因在GenBank 的登錄號(hào)為MW802630。

圖1 SmVS 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。M: DL2000; 1~3: SmVS 基因。Fig. 1 Electrophoretic diagram of PCR amplification products of SmVS. M:DL2000 marker; 1-3: SmVS.

圖2 SmVS 基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列Fig. 2 Nucletide sequence of SmVS and encoded amino acid sequence

2.2 生物信息分析

利用ProtParam 軟件對(duì)SmVS編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析, 結(jié)果表明，SmVS 蛋白分子式為C1200H1857N329O347S13，由20 種共241 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為26 861.72，原子總數(shù)為3 746，等電點(diǎn)(pI)為5.66，不穩(wěn)定系數(shù)為43.95，預(yù)估在哺乳動(dòng)物體外的網(wǎng)織紅細(xì)胞的半衰期是30 h、酵母體內(nèi)大于20 h、大腸桿菌體內(nèi)大于10 h，脂肪族指數(shù)74.02，總平均親水性為-0.208?？缒^(qū)分析表明SmVS 未形成跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白。預(yù)測(cè)SmVS蛋白的亞細(xì)胞定位于線(xiàn)粒體，可能性為73.9%；定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性為17.4%；定位于細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核的可能性較低，均為4.3%。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明(圖3: A)，約有35.27%的氨基酸(85 個(gè))以α螺旋形式存在，17.01%的氨基酸(41 個(gè))為延伸主鏈，4.98%的氨基酸(12 個(gè))為β轉(zhuǎn)角，42.74%的氨基酸(103 個(gè))為無(wú)規(guī)則卷曲,表明該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。用SWISS-MODEL對(duì)SmVS蛋白的氨基酸序列進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖3: B)，該蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件還是螺旋、折疊和卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

圖3 SmVS 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三維結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of secondary (A) and three dimensional (B) structures for SmVS

2.3 SmVS 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取6 種植物的VS 氨基酸序列，利用DNA MAN 軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)分析(圖4: A)，結(jié)果表明，這些VS 蛋白間具有較高的相似性。同時(shí)，SmVS蛋白功能域的氨基酸組成與其他植物幾乎一致，具有相同的保守域(Motif 1)(圖4: B)，其中DFGWG結(jié)構(gòu)域是幾乎所有BAHD 家族成員都有的，然而該結(jié)構(gòu)域在不同酶中會(huì)有些許差異，如DFGWG 結(jié)構(gòu)域在楊樹(shù)(Populussp.)的BAHD 家族基因中成為DYGWG、DFGFG、DFGWA、NFGWG、DFGWK、DLGFG 和NLGWG[18]。

圖4 VS 的氨基酸序列比對(duì)(A)和保守域(B)分析Fig. 4 Alignment of amino acid sequence and conserved domain of VS

根據(jù)NCBI Blast 對(duì)比結(jié)果，SmVS 蛋白的氨基酸序列與其他植物的同源性較高，與野生油橄欖(Olea europaeavar.sylvestris)的VS 氨基酸序列相似度為64%。在MEGA X 軟件平臺(tái)上采用NJ 法(bootstrap 設(shè)置為1 000)對(duì)11 種植物的VS 氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖5)，包括丹參(MW802630)、野生油橄欖(LOC111382475)、歐基尼奧伊德斯種咖啡(Coffea euge-nioides, LOC113763265)、煙草(Nicotiana tabacum, LOC 107765976)、茶樹(shù)(Camellia sinensis, LOC114266018)、牽牛(Ipomoea nil, LOC109155698)、芝麻(Sesamum indicum, LOC105168028)、苦瓜(Momordica charantia,LOC111007275)、南瓜(Cucurbita moschata, LOC11 1439839)、哥倫比亞錦葵(Herrania umbratical, LOC11 0418295)和胡桃(Juglans regia, LOC108985508)。結(jié)果表明，SmVS 與野生油橄欖的VS 聚為一支，親緣關(guān)系最近, 其次是歐基尼奧伊德斯種咖啡。系統(tǒng)進(jìn)化和序列比對(duì)結(jié)果一致, 相似性越高親緣關(guān)系越近，可見(jiàn)Vinorine 合成酶在進(jìn)化過(guò)程中是相對(duì)保守的。

圖5 基于氨基酸序列的VS 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic tree of VS based on amino acid sequences

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

為了解SmVS基因在丹參中的表達(dá)模式，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)SmVS基因的相對(duì)表達(dá)量?？梢?jiàn)，SmVS基因在根和葉中均有表達(dá)，根中的表達(dá)是葉中的近2 倍(圖6: A), 且葉中SmVS基因在21:00 達(dá)最大值(圖6: B)。

圖6 SmVS 基因的表達(dá)模式。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 6 Expression pattern of SmVS. Different letters upon column indicate significant differences at 0.05 level.

3 結(jié)論和討論

本文從丹參中克隆得到了SmVS基因，全長(zhǎng)為726 bp。生物信息學(xué)分析表明，SmVS基因編碼241個(gè)氨基酸，SmVS 蛋白的分子量為26 861.72，等電點(diǎn)PI 為5.66，為非跨膜蛋白，推測(cè)其定位于線(xiàn)粒體。氨基酸同源性分析表明，SmVS 蛋白功能域的氨基酸組成與其他植物的VS 有較高的一致性，具有相同的保守域(Motif 1)，SmVS 蛋白具有BAHD 家族的保守結(jié)構(gòu)域DFGWG，因此，推測(cè)SmVS基因可能屬于BAHD 家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明丹參的SmVS 蛋白與野生油橄欖親緣關(guān)系較近。RT-qPCR結(jié)果表明，SmVS基因在丹參根中的表達(dá)量比葉中高，說(shuō)明其在丹參中具有組織特異性；葉中SmVS在21:00 時(shí)表達(dá)最高。這些為丹參生物堿的代謝調(diào)控研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

單萜類(lèi)吲哚生物堿阿嗎靈，1931 年首次從蛇根木(Rauvolfia serpentina)樹(shù)皮中分離得到[23]，1959年上市，屬于Ia 類(lèi)抗心律失常藥物，臨床上主要用于治療預(yù)激綜合征伴發(fā)的心律失常[24]。乙酰輔酶A依賴(lài)酶的Vinorine 合成酶是從蛇根木(Rauvolfifia serpentina)和直瑞茲亞(Rhazya stricta)的雜交細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中分離出來(lái)的[25]。乙酰輔酶A 依賴(lài)的?；D(zhuǎn)移酶在植物細(xì)胞的次生代謝中起重要作用[26]。用于癌癥治療的二聚生物堿長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿的生物合成前體單萜吲哚生物堿長(zhǎng)春堿在長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)的生物合成過(guò)程中，發(fā)生了乙酰轉(zhuǎn)移[27-28]；二萜生物堿紫杉醇在東北紅豆杉(Taxus cuspidata)中的生物合成中，涉及到幾種?；D(zhuǎn)移酶，其中有2 種乙酰輔酶A 依賴(lài)性酶[29]。在阿嗎靈生物合成途徑中，乙酰輔酶A 依賴(lài)型Vinorine合成酶通過(guò)連接2 種不同類(lèi)型的生物堿, 即蛇根精和阿嗎靈生物堿，在合成代謝途徑中起重要作用。

SmVS編碼的氨基酸序列和其他6 種植物具有相同的保守域，即SmVS 蛋白具有BAHD 家族成員的保守結(jié)構(gòu)域DFGWG，因此，推測(cè)SmVS 屬于BAHD 家族的一員。最近幾年報(bào)道的BAHD 家族成員數(shù)目不斷增長(zhǎng)，目前在水稻(Oryza sativa)、楊樹(shù)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分別有119、94 和64個(gè)相關(guān)基因[30-31]，而丹參中還未見(jiàn)報(bào)道。BAHD 家族中大多數(shù)功能已知的成員參與很多次生代謝過(guò)程，如花香、花青素的生物合成, 尤其是許多具有臨床治療價(jià)值的生物堿的合成，如嗎啡、紫杉醇、長(zhǎng)春花堿和阿嗎靈等[30]。該家族成員有很多保守區(qū)域，第1 個(gè)是位于酶中心HXXXD 結(jié)構(gòu)域，對(duì)于乙?；D(zhuǎn)移酶的反應(yīng)非常重要，第2 個(gè)是位于碳端的DFGWG 結(jié)構(gòu)域，是所有BAHD 成員都擁有的結(jié)構(gòu)域[17]。

表達(dá)分析表明，SmVS基因的轉(zhuǎn)錄水平受不同組織和時(shí)間的影響，在根中表達(dá)量比葉中高，說(shuō)明丹參生物堿多在根中合成。在基因工程中利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)丹參發(fā)根，比利用根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)能產(chǎn)生更多的阿嗎靈型生物堿vinorine；葉片中SmVS基因在白天的轉(zhuǎn)錄水平極低，夜間逐漸升高，21:00達(dá)到最大值，可見(jiàn)該生物堿主要在夜間合成。植物的生長(zhǎng)發(fā)育受外界很多因素影響，如光照、低溫、干旱等，其中光照是一種重要的環(huán)境因子，植物體內(nèi)存在很多光響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠感受光的刺激而誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)，最終影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝等[32-33]。Liu 等[34]報(bào)道長(zhǎng)春花葉中生物堿vindoline 的合成受光調(diào)控，其光應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子CrGATA1 可以調(diào)控vindoline 生物合成，CrGATA1的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)導(dǎo)致長(zhǎng)春花文多靈途徑基因的上調(diào)，最終增加了vindoline 的積累。因此，我們推測(cè)SmVS基因也是一個(gè)光應(yīng)答基因，其轉(zhuǎn)錄水平受光的調(diào)控。