付偉, 李林, 康宇, 龍瀾, 楊永康, 殷紅清*, 向極釬,梅磊

(1. 恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445000；2. 湖北省富硒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 恩施 445000；3. 中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093)

活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)是植物細(xì)胞在需氧代謝過程中產(chǎn)生的具有高度化學(xué)反應(yīng)活性的含氧集團(tuán)，如超氧陰離子自由基(O2-·)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(1O2)等。當(dāng)植物遭受脅迫時，抗氧化酶系統(tǒng)受到損傷導(dǎo)致活性氧大量積累，引起一系列生理生化紊亂對植物造成損害，甚至導(dǎo)致不可修復(fù)性的代謝功能障礙以及細(xì)胞死亡[1]。在長期的進(jìn)化過程中，植物為了抵御氧化傷害，維持正常的生理代謝，形成了抗氧化酶促清除系統(tǒng)和非酶促清除系統(tǒng)協(xié)同作用清除活性氧。而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)作為植物防御系統(tǒng)的第一道防線對清除氧自由基起關(guān)鍵作用，可催化超氧陰離子自由基(O2-·)歧化生成H2O2和O2，再通過過氧化物酶和氧化物酶將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，從而實現(xiàn)活性氧的清除[2]，其活性與植物的生長發(fā)育以及抗逆性等有密切相關(guān)性[3-5]。

超氧化物歧化酶是一種含金屬的酶，其通過金屬輔因子得失電子清除活性氧自由基。根據(jù)SOD 結(jié)合的金屬輔因子種類，可分為Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD 和Ni-SOD 等4 類[5-6]。其中，Cu/Zn-SOD主要存在于高等植物的葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，與植物抗逆性有密切關(guān)系[7]。在小麥(Triticum aestivum)中,組成型表達(dá)的Cu/Zn-SOD響應(yīng)各種非生物脅迫的程度不同[8]。低溫脅迫下，茶樹(Camellia sinensis)的Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因上調(diào)表達(dá)，F(xiàn)e-SOD基因受到抑制[9]。轉(zhuǎn)基因植株中，Cu/Zn-SOD基因的過表達(dá)增強了木薯(Manihot esculenta)[10]耐旱性和甘薯(Dioscorea esculenta)[11]的鹽脅迫耐受性。而Fe-SOD 和Mn-SOD 主要分布于低等植物中，主要涉及植物的抗逆性[12]。在煙草(Nicotiana tabacum)與苜蓿(Medicago sativa)中，F(xiàn)e-SOD和Mn-SOD明顯增強了植株的抗冷、抗氧化能力[13-14]。Ni-SOD 首次從鏈霉菌(Streptomyces)中發(fā)現(xiàn)，目前報道其僅存在于少數(shù)原核生物如綠藻和細(xì)菌中[15]。Tsang 等[16]通過亞細(xì)胞和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，僅Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD 在植物中共存。

碎米薺(Cardamine hirsuta)為十字花科(Brassicaceae)碎米薺屬碎米薺組植物，分布廣泛，全株可作野菜食用和入藥[17]。有研究表明，碎米薺組有些植物具有較強的硒耐受性，如彎曲碎米薺(C. flexuosa)[18]和堇葉碎米薺(C. violifolia)[17]等。碎米薺全基因組測序的完成，為ChSOD基因家族的全基因組分析奠定了基礎(chǔ)。然而，目前尚未有從全基因組水平上對碎米薺SOD基因功能進(jìn)行研究的報道。本研究通過生物信息學(xué)對碎米薺SOD基因家族進(jìn)行全基因組鑒定分析，分析其結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系和染色體定位等信息，為碎米薺抗氧化機制研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

選取顆粒飽滿的碎米薺種子于4 ℃冰箱春化24 h 后，置于培養(yǎng)皿中黑暗催芽4 d。待種子萌發(fā)后，將其移至塑料花盆中(蛭石∶營養(yǎng)土=1∶1), 并在光周期為12 h/12 h、25 ℃下培養(yǎng)15 d，分別收集碎米薺幼苗的根、莖和葉，用液氮快速冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 SOD 基因家族成員鑒定

通過數(shù)據(jù)庫(http://chi.mpipz.mpg.de/assembly.html)下載碎米薺全基因組數(shù)據(jù)[19]，通過Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載SOD 的隱馬氏模型文件(PF00080、PF00081 和PF02777)，并以該文件為搜索條件，利用HMMER 3.0 中的Hmmsearch 程序?qū)λ槊姿j蛋白質(zhì)序列進(jìn)行搜索(E<1×10-5)，并去除重復(fù)，然后通過NCBI-CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.g/stuctu/cdd/wrpsb.cgi)和SMART (http://smart.embl heidelberg.de/)進(jìn)行鑒定和篩選，最終得到碎米薺SOD 家族蛋白質(zhì)序列。根據(jù)碎米薺基因組注釋文件信息，獲得SOD基因在染色體上的位置分布信息，并利用Map Chart 繪制碎米薺SOD基因在染色體上的定位圖。最后，利用ExPASy (https://web.expasy.org/compute_pi/)分析碎米薺SOD 的分子量、氨基酸數(shù)量和等電點。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和分類

從TAIR 數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)和RGAP 數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)分別下載擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)的SOD 氨基酸序列,利用Clustal W 對碎米薺、擬南芥和水稻的SOD 氨基酸序列進(jìn)行比對，并用MEGA 7.0 軟件通過相鄰連接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置重復(fù)次數(shù)為1 000，提高進(jìn)化分支樹結(jié)果的可靠性。

1.4 基因結(jié)構(gòu)和基序組成

利用在線網(wǎng)站GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析碎米薺SOD基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)；利用在線軟件MEME (http://memesuite.org/)分析碎米薺SOD 氨基酸序列中的保守基序，設(shè)置motif 為10;利用Clustal W 對碎米薺SOD 氨基酸序列進(jìn)行比對,并用MEGA 7.0軟件相鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置重復(fù)次數(shù)為1 000。最后利用TBtools 繪制碎米薺SOD基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因組成和基因結(jié)構(gòu)的組合圖。

1.5 順式作用元件分析

提取碎米薺SOD基因編碼序列上游1.5 kb 文件,提交到Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對順式作用元件進(jìn)行識別,并利用在線網(wǎng)站GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制碎米薺SOD基因家族順式作用元件圖[20]。

1.6 SOD 基因表達(dá)分析

取碎米薺根、莖、葉冷凍樣本各50 mg，采用Trizol 法提取總RNA，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 檢測RNA 質(zhì)量，以確?？俁NA 的完整性和濃度。參照SuperscriptⅢ first strand cDNA synthesis Kit (天根生化科技有限公司，北京)說明書進(jìn)行cDNA 第一鏈合成，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Primer Premier 3.0 進(jìn)行熒光定量PCR 引物設(shè)計(表1)，引物由睿博興科生物技術(shù)有限公司廣州分公司合成。以GADPH為內(nèi)參基因，采用Super-Real PreMix Plus (SYBR Green) PCR Kit (天根生化科技有限公司，北京)進(jìn)行實時熒光定量PCR。擴(kuò)增體系(20μL)：2×SuperReal PreMix Plus 10μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；然后95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共45 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用Graph Pad Prism 8繪制柱狀圖。

表1 qRT-PCR 引物Table 1 qRT-PCR primers

1.7 SOD 的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線網(wǎng)站SOMPA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)分別對碎米薺SOD 蛋白序列進(jìn)行二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2 結(jié)果和分析

2.1 碎米薺SOD 家族成員

通過HMMER3.0 中的Hmmsearch 程序?qū)λ槊姿j氨基酸序列進(jìn)行搜索，同時利用NCBI-CDD 和SMART 進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域鑒定，剔除了不含保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并手動去除重復(fù)的氨基酸序列和不完整的氨基酸序列，最終鑒定出10 個碎米薺SOD基因家族成員，不均勻地分布在7 條染色體上，其中在1、4 和6 號染色體上各有2 個，而3、5、7和8 號染色體上各有1 個(圖1)。

圖1 碎米薺SOD 基因的染色體分布Fig. 1 Chromosome location of ChSOD genes

對碎米薺SOD 家族成員進(jìn)行氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析表明(表2)，有4 個ChSOD(CARHR008750、CARHR121080、CARHR085500 和CARHR256990)分布在染色體正義鏈上，其余6 個分布在反義鏈上；氨基酸序列長度為57 (CARHR120080)~324 (CARH R012800)；蛋白質(zhì)分子量為6 419.41~34 659.01 kDa;等電點在4.92~9.60，且酸性蛋白較多。

表2 碎米薺SOD 基因及其編碼蛋白信息Table 2 ChSOD genes and information of their encoding proteins

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過Clustal W 對碎米薺10 個SOD 的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明(圖2)，SOD 的氨基酸序列間同源性較高，且主要集中在C 端，該區(qū)域可能是SOD 蛋白行使功能的關(guān)鍵區(qū)域。

用MEGA 7.0 對碎米薺、擬南芥和水稻SOD 家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了比較，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果表明(圖3)，相較于水稻，碎米薺與擬南芥的SOD 蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)而聚在一起，說明碎米薺與擬南芥同源性較高，可通過分析擬南芥相應(yīng)同源序列來推測碎米薺基因的功能；此外，進(jìn)化樹還表明，Cu/Zn-SOD 起源于同一分支, 而Mn-SOD、Fe-SOD 起源于另一分支，表明碎米薺Mn-SOD 和Fe-SOD 也可能起源于同一祖先。

圖3 碎米薺(▲)、擬南芥(●)和水稻(■)中SOD 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of SOD in Cardamine hirsuta (▲), Arabidopsis thaliana (●) and Oryza sativa (■)

2.3 SOD 基因結(jié)構(gòu)和基序組成

基因結(jié)構(gòu)分析表明，ChSODs含有2~9個外顯子，其中CARHR256990 含有9 個外顯子，而CARHR 120080 僅有2 個外顯子(圖4)。而對ChSOD 進(jìn)行保守基序分析表明，同一亞族內(nèi)的SOD 保守基序的種類與數(shù)量大體相同，而不同亞族內(nèi)的SOD 保守基序的種類和數(shù)量差異較大，Motif 3、Motif 5 僅出現(xiàn)在Fe-SOD/Mn-SOD (CARHR012800、CARHR194970、CARHR008750 和CARHR121080)分支中，而其余8種Motif 只存在于Cu/Zn-SOD (CARHR256990、CAR HR120080、CARHR190230、CARHR232490、CARHR 085500 和CARHR166500)分支中。

圖4 碎米薺SOD 家族成員的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(A)、基序(B)和基因結(jié)構(gòu)(C)Fig. 4 Phylogenetic tree (A), motiff (B) and gene structure (C) of ChSOD members

2.4 ChSODs 啟動子順式作用元件分析

為了進(jìn)一步研究ChSODs 在非生物脅迫響應(yīng)中的潛在機制，提取ChSODs 起始位點上游1.5 kb 序列，提交到Plant CAR 檢測順式作用元件，包括ABA響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MBS)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、防御和應(yīng)激反應(yīng)元件(TC-rich)和創(chuàng)傷響應(yīng)元件(WUN-motif)。從圖5 可見，ChSODs 含有2~11個順式作用元件，其中CARHR008750、CARHR01 2800 和CARHR194970 僅有2 個順式作用元件，而CARHR166500 有11 個順式作用元件。此外，有6個ChSODs 基因具有ABA 響應(yīng)元件，5 個基因具有LTR 響應(yīng)元件，5 個基因具有TC-rich 響應(yīng)元件，4個基因具有WUN-motif 響應(yīng)元件和4 個基因具有MBS 響應(yīng)元件。因此，推測在響應(yīng)非生物脅迫時,ChSODs 對ABA 和低溫脅迫響應(yīng)更敏感[20]。

圖5 預(yù)測ChSOD 啟動子中的順式元件。ABRE: ABA; LTR: 低溫; MBS: 干旱; TC-rich: 應(yīng)激反應(yīng); WUN-motif: 創(chuàng)傷。Fig. 5 Predicted cis-elements in ChSOD promoters. ABRE: ABA; LTR: Low temperature; MBS: Drought; TC-rich: Stress; Wun-motif: Trauma.

2.5 ChSODs 表達(dá)分析

基因的組織表達(dá)與功能密切相關(guān)，從圖6 可見,ChSODs 在碎米薺根、莖和葉中均有表達(dá)，以葉中的表達(dá)量最高，其次為莖和根。另外，CARHR08 5500 在葉和莖中的表達(dá)量最高(分別為根的8 和5倍), 其次為CARHR256690 (分別為根的5 和3 倍)。

圖6 ChSODs 在不同組織中的表達(dá)。1~10 見表2。n=3; 相同基因柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 6 Expression of ChSODs in different tissues. 1-10 see Table 2. n=3; Different letters upon column of the same gene indicate significant difference at 0.05 level.

2.6 ChSOD 蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOMPA 預(yù)測可知，在ChSOD 家族成員的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈較高，而β-轉(zhuǎn)角較低。其中多數(shù)蛋白質(zhì)的α-螺旋占25.08%~54.55%，無規(guī)則卷曲為29.82%~56.36%，延伸鏈為11.69%~32.89%，而β-轉(zhuǎn)角絕大多數(shù)低于10%。因此，預(yù)測在ChSOD 蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋、無規(guī)則卷曲起主要作用(表3)。

表3 ChSOD 蛋白二級結(jié)構(gòu)Table 3 Secondary structure of ChSOD

SWISS-MODEL 對ChSOD 家族成員的蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，ChSOD 蛋白均含有α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲等空間構(gòu)象，但結(jié)構(gòu)具有差異性；另外，各ChSOD 蛋白含有的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)數(shù)目存在差異(圖7)。

圖7 ChSOD 蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig. 7 Tertiary structure of ChSOD

3 結(jié)論和討論

SOD 是植物體內(nèi)清除氧自由基的關(guān)鍵酶，其活性與植物生長發(fā)育和抗逆性等密切相關(guān)[3-5]。近年來，隨著全基因組分析技術(shù)的發(fā)展，已對許多植物的SOD 家族成員進(jìn)行了分析，并證明其參與調(diào)控植物的多重生理過程，如玉米(Zea mays)[21]、擬南芥[22]、水稻[23]、油菜(Brassica napus)[24]等。隨著基因組學(xué)的發(fā)展和碎米薺全基因組測序的完成，為解析碎米薺SOD基因家族成員的功能提供了理論和技術(shù)支持。

本研究中，通過生物信息學(xué)方法共鑒定出了10個碎米薺ChSOD基因，其結(jié)構(gòu)簡單，且大多編碼親水性蛋白，表明碎米薺ChSOD基因結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，基因在進(jìn)行復(fù)制時較難發(fā)生可變剪切，功能相對穩(wěn)定。根據(jù)SOD 蛋白活性中心金屬輔因子的類型, 可將其分為Mn-SOD、Cu/Zn-SOD 和Fe-SOD，其中，組成型表達(dá)的Cu/Zn-SOD 和Fe-SOD 含量較穩(wěn)定,既參與清除代謝過程中產(chǎn)生的ROS，也參與植物抗逆性形成；Mn-SOD 的表達(dá)極易受外界影響，在清除逆境脅迫產(chǎn)生的大量ROS 中發(fā)揮著重要作用[25]。研究表明，Cu/Zn-SOD 對植物的多種抗逆性尤為重要，如抗寒、抗旱、耐鹽堿等[24,26-27]。碎米薺10 個ChSOD基因中，有6 個薺ChSOD基因鑒定為Cu/Zn-SOD基因，說明碎米薺抗逆性與SOD 密切相關(guān)，且Cu/Zn-SOD 可能發(fā)揮主導(dǎo)作用。

前人根據(jù)SOD 蛋白的結(jié)構(gòu)同源性推測，不同物種的Mn-SOD 和Fe-SOD 蛋白可能起源于同一祖先——光合細(xì)菌[28-29]。劉家林等[23]證實了水稻Mn-SOD 和Fe-SOD 可能起源于同一祖先。對碎米薺SOD蛋白進(jìn)行預(yù)測，顯示Cu/Zn-SOD 歸于一支，而Mn-SOD 和Fe-SOD 歸于另一分支，表明在碎米薺中,Mn-SOD 和Fe-SOD 蛋白也可能起源于同一祖先。而不同SOD 家族成員間的理化性質(zhì)的差異性可能與產(chǎn)生旁系同源基因，形成新的生物學(xué)功能，以更好地適應(yīng)環(huán)境[30]。與水稻相比，碎米薺的ChSOD與擬南芥的AtSOD 親緣關(guān)系更近，可能與同屬于雙子葉植物有關(guān)，據(jù)此，可通過擬南芥AtSOD功能來推測碎米薺ChSOD基因的功能。基因在組織中的表達(dá)量與功能密切相關(guān)，ChSOD在葉中的高表達(dá)可能與葉片活躍的光合作用有關(guān)。CARHR085500和CARHR256690 在碎米薺葉和莖中表達(dá)量較高, 這與前人[31]報道Cu/ZnSOD轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要集中于根和莖的結(jié)果一致。此外，高等植物的基因表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控，且受多種順式作用元件和反式作用因子的相互調(diào)節(jié)。對ChSOD啟動子順式作用元件預(yù)測表明，碎米薺SOD啟動子中含有ABA、干旱、低溫、防御、應(yīng)激和創(chuàng)傷等非生物脅迫響應(yīng)元件，且含有ABA 和低溫響應(yīng)元件的基因較多，推測ChSOD在響應(yīng)非生物脅迫時，可能對ABA 和低溫脅迫響應(yīng)更敏感。這有助于了解基因調(diào)控模式，對深入了解碎米薺的生長機制及其外界環(huán)境的調(diào)控模式具有重要意義。

在碎米薺全基因組中，共鑒定出10 個SOD基因，分布在7 條染色體上；ChSOD 蛋白的分子量與氨基酸數(shù)目成正比，且多數(shù)為酸性蛋白；ChSOD基因含有2~11 個外顯子。碎米薺SOD基因包含6 個Cu/Zn-SOD、3 個Fe-SOD和1 個Mn-SOD，可分為2 個亞家族，位于同一亞族的SOD基因具有相似的保守基序和基因結(jié)構(gòu)。碎米薺ChSOD 與擬南芥AtSOD 的同源性較高。qRT-PCR 分析表明，ChSODs在碎米薺根、莖和葉中均有表達(dá)，以葉中的表達(dá)量最高。CARHR085500 在碎米薺葉和莖中的表達(dá)量最高，其次為CARHR256690。在響應(yīng)非生物脅迫時，ChSODs 對ABA 和低溫脅迫響應(yīng)較敏感。ChSOD蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)中，以α-螺旋和無規(guī)則卷曲比例較高，可能起主導(dǎo)作用，但不同ChSOD 蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)存在差異。