于 建，高五集，段永彬，陸樞椏，鐘加滕,

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，河南 新鄉(xiāng) 453003)

慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是骨髓造血干細(xì)胞異?？寺⌒栽鲋承纬傻膼盒阅[瘤，絕大多數(shù)患者起病緩慢。隨著酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼的研發(fā)，患者保守治療取得不錯的效果，但是長期接受伊馬替尼治療的CML患者超過30%出現(xiàn)了耐藥或者不耐受，這使得尋找新的治療策略和靶點(diǎn)迫在眉睫[1-2]。腫瘤細(xì)胞不受控制的生長和增殖需要通過糖酵解獲得大量的能量和代謝產(chǎn)物。3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate,3-BP)是糖酵解中關(guān)鍵激酶己糖激酶(hexokinase,HK)2的抑制劑。有文獻(xiàn)報道，3-BP 可通過抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解抑制腫瘤細(xì)胞生長[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路作為凋亡途徑通路的一種，在抑制腫瘤細(xì)胞生長中同樣發(fā)揮著重要作用[4]。3-BP 對髓系白血病細(xì)胞的作用及對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路的影響還未見報道。研究顯示，牛熊去氧膽酸鈉(sodium taursus deoxycholate，TUDCA)治療膽石癥及肝病有顯著的效果[5-6]。近年來，TUDCA在其他疾病的治療方面也引起了廣泛的關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)，TUDCA具有抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的作用，可以作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑[16]。本研究通過探討 3-BP單獨(dú)或聯(lián)合TUDCA對髓系白血病細(xì)胞存活、增殖、凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)的影響，以期為臨床治療CML及聯(lián)合用藥提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器人髓系白血病細(xì)胞K562購自武漢普諾賽生物科技有限公司；3-BP、Tubulin抗體購自美國Sigma公司，TUDCA、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自美國Med Chem Express公司，B 淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax) 抗體購自上海Abways公司， cleaved-caspase-3、免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin-binding protein，Bip)、真核翻譯起始因子-2α(eukaryotic translation initiation factor-2α，EIF-2α)抗體購自美國CST公司，磷酸化真核翻譯起始因子-2α(phosphorylated eukaryotic translation initiation factor-2α，p-EIF-2α)、轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)抗體購自德國Snta cruz公司，人膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒購自日本同仁公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) 凝膠配制試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)購自武漢普諾賽生物科技公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自武漢塞維爾公司;酶標(biāo)儀購自武漢賽默飛公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司，電轉(zhuǎn)儀、電泳儀購自北京六一儀器公司，金屬浴購自山東博科科學(xué)儀器公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將K562細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8檢測細(xì)胞存活能力收集對數(shù)生長期K562細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基重懸，以每孔1.2×104個細(xì)胞接種于96孔板中，并隨機(jī)分為0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組，分別用含終濃度0、40、80、120 μmol·L-13-BP的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；另鋪96孔板，并隨機(jī)分為對照組、3-BP組、TUDCA組、3-BP+TUDCA組，分別使用含終濃度0 μmol·L-13-BP和0 mmol·L-1TUDCA 、40 μmol·L-13-BP、0.25 mmol·L-1TUDCA、40 μmol·L-13-BP和0.25 mmol·L-1TUDCA的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。每組設(shè)6個復(fù)孔。細(xì)胞鋪板并加藥后，每隔2 h觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，藥物干預(yù)16 h后，加入CCK-8試劑，置于 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h。使用酶標(biāo)儀于波長 450 nm 處測定光密度(optical density，OD)值。OD值越高表示細(xì)胞存活能力越強(qiáng)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力收集對數(shù)生長期K562細(xì)胞，以每孔3 000個細(xì)胞接種于5個96孔板，每個96孔板隨機(jī)分為0 μmol·L-13-BP組、5 μmol·L-13-BP組、10 μmol·L-13-BP組、20 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組，分別用含終濃度0、5、10、20、40 μmol·L-13-BP 的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。5組細(xì)胞使用不同濃度3-BP培養(yǎng)0、24、48、72、96 h時，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h，使用酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測OD值。OD值越高表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況收集對數(shù)生長期K562細(xì)胞，以每孔2.5×106個細(xì)胞均勻鋪于6孔板中，并隨機(jī)分為0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組，分別用含終濃度0、40、80、120 μmol·L-13-BP的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。另取對數(shù)生長期K562細(xì)胞鋪6孔板，并隨機(jī)分為對照組、3-BP組、TUDCA組、3-BP+TUDCA組，3-BP組、TUDCA組、3-BP+TUDCA組細(xì)胞分別用含終濃度40 μmol·L-13-BP、0.25 mmol·L-1TUDCA、40 μmol·L-13-BP和0.25 mmol·L-1TUDCA培養(yǎng)，對照組細(xì)胞不加藥培養(yǎng)。每組設(shè)6個復(fù)孔。藥物作用12 h后，使用Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒處理細(xì)胞，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.6 Western blot法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)取藥物干預(yù)12 h的0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組及對照組、3-BP組、TUDCA組、3-BP+TUDCA組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞至離心管中，800 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。加入適量細(xì)胞裂解液吹打混勻，置于冰上裂解20 min，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將所提蛋白置于金屬浴100 ℃、10 min變性。使用SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白恒壓轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h,Tris緩沖生理鹽水洗滌；加入Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、Bip、EIF-2α、p-EIF-2α、ATF4一抗(稀釋度11 000)，4 ℃孵育過夜，Tris緩沖生理鹽水洗滌3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋度12 000)，室溫?fù)u床孵育1 h， Tris緩沖生理鹽水洗膜3次，每次10 min；滴加電化學(xué)發(fā)光顯色劑，暗室中曝光、顯影，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析各條帶灰度值，以Tubulin為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值與Tubulin條帶灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 3-BP對髓系白血病細(xì)胞K562存活能力的影響3-BP 干預(yù)16 h時，0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組細(xì)胞的OD值分別為 1.164±0.031、0.910±0.037、0.729±0.033、0.384±0.010；隨著藥物濃度的升高， 0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組細(xì)胞存活能力(OD值)呈顯著降低趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=542.170，P<0.05)。

2.2 3-BP聯(lián)合TUDCA對髓系白血病細(xì)胞K562存活能力的影響藥物干預(yù)16 h時，對照組、3-BP組、TUDCA組、3-BP+TUDCA組細(xì)胞OD值分別為0.968±0.417、0.760±0.010、0.740±0.012、0.315±0.010。3-BP組、TUDCA組、3-BP+TUDCA組細(xì)胞的存活能力(OD值)顯著低于對照組，3-BP+TUDCA組細(xì)胞的存活能力(OD值)顯著低于3-BP組和TUDCA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3-BP組與TUDCA組細(xì)胞的存活能力(OD值)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 3-BP對髓系白血病細(xì)胞K562增殖能力的影響結(jié)果見表1。3-BP干預(yù)0 h時，0 μmol·L-13-BP組、5 μmol·L-13-BP組、10 μmol·L-13-BP組、20 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組細(xì)胞的增殖能力(OD值)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F= 2.284,P>0.05)。3-BP干預(yù)24、48、72、96 h時，隨3-BP干預(yù)濃度的升高，0 μmol·L-13-BP組、5 μmol·L-13-BP組、10 μmol·L-13-BP組、20 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組細(xì)胞的增殖能力(OD值)呈顯著降低趨勢(F=284.875、819.658、199.535、467.633，P<0.05)。3-BP干預(yù)0、24、48、72、96 h時，隨干預(yù)時間的延長，0 μmol·L-13-BP組、5 μmol·L-13-BP組3-BP組、10 μmol·L-13-BP組、20 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組細(xì)胞的增殖能力(OD值)呈顯著升高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同濃度3-BP組髓系白血病細(xì)胞K562增殖能力的比較

2.4 3-BP對髓系白血病細(xì)胞K562凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖1、圖2和表2。隨著3-BP干預(yù)濃度的增加，0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組細(xì)胞的凋亡率及Bax、cleaved-capsase-3蛋白相對表達(dá)量呈顯著升高趨勢，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量呈顯著降低趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2 148.278、1 176.838、1 350.646、6 765.482，P<0.05)。

A:0 μmol·L-1 3-BP組;B:40 μmol·L-1 3-BP組;C:80 μmol·L-1 3-BP組;D:120 μmol·L-1 3-BP組。

1:0 μmol·L-13-BP組；2:40 μmol·L-13-BP組；3:80 μmol·L-1 3-BP組；4:120 μmol·L-13-BP組。

表2 不同濃度 3-BP組K562細(xì)胞凋亡率及K562細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較

2.5 3-BP對髓系白血病細(xì)胞K562細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見表3和圖3。隨著3-BP濃度的升高，0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組細(xì)胞Bip、p-EIF-2α、ATF4蛋白相對表達(dá)量呈顯著升高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 600.447、504.672、1 949.837，P<0.05)。0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組細(xì)胞的EIF-2α蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.034，P>0.05)。

表3 不同濃度3-BP組K562細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較

A：0 μmol·L-13-BP組；B：40 μmol·L-13-BP組；C：80 μmol·L-13-BP組；D：120 μmol·L-13-BP組。

2.6 3-BP聯(lián)合TUDCA對髓系白血病細(xì)胞K562細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響結(jié)果見表4和圖4、5。3-BP組、TUDCA組、3-BP+TUDCA組細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組，TUDCA組細(xì)胞凋亡率顯著低于3-BP組，3-BP+TUDCA組細(xì)胞凋亡率顯著高于3-BP、TUDCA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3-BP組、TUDCA組、3-BP+TUDCA組細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均顯著低于對照組，Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3-BP+TUDCA組細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量顯著低于3-BP組、TUDCA組，Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量均顯著高于3-BP組、TUDCA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3-BP組與TUDCA組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4 對照組、3-BP組、TUDCA組、3-BP+TUDCA組K562細(xì)胞凋亡率及K562細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較

A:對照組;B:3-BP組;C:TUDCA組;D:3-BP+TUDCA組。

1:對照組；2：3-BP組；3：TUDCA組；4：3-BP+TUDCA組。

3 討論

CML是一種起源于多能干細(xì)胞的增殖性髓系腫瘤，急變期CML患者緩解率較低，預(yù)后差。因此，尋找新的有效的治療方案尤其是聯(lián)合用藥方案成為控制CML發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。

腫瘤細(xì)胞往往通過糖酵解的方式獲取能量，而不是正常細(xì)胞的有氧循環(huán)方式獲取能量，腫瘤細(xì)胞這種代謝方式的改變稱為代謝重編程，也稱為 “Warburg效應(yīng)”[8-9]。糖酵解途徑中第一限速酶HK的基因參與了腫瘤細(xì)胞代謝重編程的過程。 HK已知有4種類型，由不同染色體的不同基因控制，其中HK2與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系最為密切[10-11]。大量研究顯示，HK2在多種腫瘤中呈高表達(dá)，并且在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12-14]。3-BP是研究最廣泛的HK2抑制劑，但是其對白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目前尚不清楚，且關(guān)于是否存在可能的聯(lián)合用藥方案報道較少[15-16]?；诖?，本研究通過給予人髓系白血病細(xì)胞K562不同濃度的3-BP，研究3-BP對K562細(xì)胞存活、增殖和凋亡的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3-BP 干預(yù)16 h時，隨著藥物濃度的升高，0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組細(xì)胞存活能力(OD值)呈顯著降低趨勢；3-BP干預(yù)24、48、72、96 h時，隨3-BP干預(yù)濃度的升高，0 μmol·L-13-BP組、5 μmol·L-13-BP組、10 μmol·L-13-BP組、20 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組細(xì)胞的增殖能力(OD值)呈顯著降低趨勢；隨著3-BP干預(yù)濃度的增加，0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組細(xì)胞的凋亡率及促凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-caspase-3呈顯著升高趨勢，抑制性凋亡蛋白Bcl-2呈顯著降低趨勢；提示3-BP可以顯著抑制K562細(xì)胞的增殖能力，降低細(xì)胞存活率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax 基因是人體線粒體凋亡途徑中最主要的凋亡基因，對Bcl-2具有抑制作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，Bax/Bcl-2蛋白比例是決定對細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，Bax被認(rèn)為是非常重要的促細(xì)胞凋亡基因之一[18]。正常情況下，caspase 3以酶原的形式存在,但是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時,caspase 3被活化為cleaved-caspase-3，并發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[19]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊、存儲的重要細(xì)胞器。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生錯誤蛋白折疊或鈣離子超載時，細(xì)胞會發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[20]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時，未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上堆積，會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白Bip從跨膜蛋白上解離，并與未折疊蛋白結(jié)合[21]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過于強(qiáng)烈時，會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡中發(fā)揮著雙重作用，既可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，也可維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[22-23]。本研究使用不同濃度3-BP處理K562細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著3-BP 濃度的升高，0 μmol·L-13-BP組、40 μmol·L-13-BP組、80 μmol·L-13-BP組、120 μmol·L-13-BP組細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip、p-EIF-2α、ATF4相對表達(dá)量呈顯著升高趨勢，提示3-BP所誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡可能通過激活Bip、p-EIF-2α、ATF4蛋白表達(dá)引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。

本研究進(jìn)一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDCA和3-BP聯(lián)合應(yīng)用對K562細(xì)胞存活、凋亡的影響及機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3-BP+TUDCA組細(xì)胞的存活能力顯著低于對照組、3-BP組、TUDCA組，凋亡率顯著高于對照組、3-BP組、TUDCA組；3-BP+TUDCA組細(xì)胞中促凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-caspase-3相對表達(dá)量顯著高于對照組、3-BP組、TUDCA組，抑制性凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)量顯著低于對照組、3-BP組、TUDCA組，提示3-BP作用于K562細(xì)胞所引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)對K562細(xì)胞發(fā)揮了保護(hù)作用；3-BP 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDCA聯(lián)合用藥則抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)了K562細(xì)胞凋亡，抑制K562細(xì)胞存活。

綜上所述，3-BP可顯著抑制人髓系白血病細(xì)胞K562的增殖和存活能力，促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡，并可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。此外，3-BP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDCA聯(lián)合用藥可增加3-BP對K562細(xì)胞的促凋亡作用，抑制K562細(xì)胞存活。本研究為臨床靶向有氧糖酵解治療白血病提供了一定的方向和理論依據(jù)，也為聯(lián)合用藥治療CML提供了新的策略。