宋明明，田林強，董新文，姚三巧，孟偉正，任文杰，王桂芝

(1.平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院急診科，河南 平頂山 467000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院創(chuàng)傷與骨科研究所，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052)

煤礦瓦斯爆炸事故現(xiàn)場人員死亡率高[1-2]，幸存?zhèn)麊T多有燒沖復(fù)合傷。呼吸道阻塞、肺部損傷多發(fā)、早期臨床表現(xiàn)隱匿、臨床治療矛盾重重為燒沖復(fù)合傷后期死亡主要原因[3]。目前，雖然國內(nèi)學(xué)者在瓦斯爆炸傷的救治工作中取得了一定的進(jìn)展，但由于煤礦瓦斯爆炸事故通常比較分散，只有很少的醫(yī)院有機(jī)會收治瓦斯爆炸傷患者，且瓦斯爆炸對人體的傷害數(shù)據(jù)較難獲取，仍存在著基礎(chǔ)研究薄弱、燒沖復(fù)合傷救治方法欠科學(xué)、救治理念不統(tǒng)一等一系列亟待解決的難題[4-5]，故通過動物實驗來研究瓦斯爆炸對機(jī)體的傷害及修復(fù)機(jī)制有非常重要的意義。本研究采用φ2000瓦斯爆炸系統(tǒng)對大鼠進(jìn)行瓦斯爆炸實驗，觀察大鼠死亡及存活情況、損傷部位和傷情特點，以及支氣管及肺組織中caspase-3、caspase-9表達(dá)水平，探討瓦斯爆炸事故實驗室研究的條件，以達(dá)到精準(zhǔn)動物建模、從分子層面闡明瓦斯爆炸致支氣管及肺損傷的發(fā)生機(jī)制，為煤礦瓦斯爆炸傷害院前急救護(hù)理及臨床救治提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級Sprague Dawley大鼠116只，6～8月齡，體質(zhì)量230～270 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動物中心提供，飼養(yǎng)于該中心無特定病原體級動物房。所有大鼠自由進(jìn)食水。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 瓦斯爆炸系統(tǒng)及裝置應(yīng)用中國煤炭科工集團(tuán)重慶研究院研制的φ2000瓦斯爆炸系統(tǒng)，管道直徑2 m，長29 m，整個管道預(yù)試驗安裝3個壓力傳感器，正式實驗安裝4個壓力傳感器，實驗動物距離出口 3.5 m 處。數(shù)據(jù)采集應(yīng)用成都泰斯特電子信息有限責(zé)任公司開發(fā)的CS2000動態(tài)測試分析系統(tǒng)。電源采用12 V穩(wěn)壓直流電源，所測波形為非矩形波，火焰到達(dá)該點時間以波形第1個跳變時間為準(zhǔn)。溫度傳感器為中科院自動化研究所生產(chǎn)的CIT-2MK紅外線性化溫度傳感器，測溫范圍 40～2 000 ℃，采用15 V直流穩(wěn)壓電源，測量精度為滿量程的±1%，響應(yīng)時間為67 ms，適于在0～60 ℃環(huán)境下使用。應(yīng)用陜西秦明電子(集團(tuán))有限公司寶雞傳感器研究所生產(chǎn)的 CYG系列固態(tài)壓阻壓力傳感器，在測試過程中通過自制前置放大器接入CS20000動態(tài)測試分析系統(tǒng)，傳感器量程分別為2× 105Pa和1 × 105MPa，適于在-40～80 ℃范圍內(nèi)使用，輸出信號范圍0～5 V，非線性為±0.08%，過載能力200%。

1.3 方法

1.3.1 瓦斯?jié)舛仍O(shè)定及動物分組和處理將116只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后分為實驗組(n=96)和對照組(n=20)。實驗組大鼠均勻放置于自行設(shè)計的雙層鼠籠內(nèi)，用角鋼焊接的方式將鼠籠固定在爆炸裝置內(nèi)。依據(jù)本課題組預(yù)實驗結(jié)果及文獻(xiàn)報道[5]。本實驗設(shè)置瓦斯?jié)舛葹?.55%，瓦斯容量為1.62 m3。起爆室達(dá)到預(yù)定的瓦斯?jié)舛燃叭萘亢螅ㄟ^點火系統(tǒng)進(jìn)行點火，使瓦斯在管道爆炸并傳播，點火的同時觸發(fā)爆炸綜合測試系統(tǒng)對傳播方向上各測點的爆炸壓力及火焰信息進(jìn)行采集。對照組大鼠不進(jìn)行瓦斯爆炸，其他實驗條件同實驗組。

1.3.2 實驗組大鼠一般情況觀察爆炸結(jié)束后，通過排風(fēng)系統(tǒng)對實驗管道進(jìn)行排風(fēng)，20 min后搜集實驗動物。對實驗組大鼠進(jìn)行生命體征、灼傷程度觀察記錄，判斷其意識、神態(tài)、呼吸情況、移動能力等。動物無生命體征判斷為死亡，包括實驗現(xiàn)場死亡及實驗結(jié)束2 h以內(nèi)死亡的動物。

1.3.3 實驗組大鼠燒沖復(fù)合傷發(fā)生情況爆炸結(jié)束后，依據(jù)實驗管道瓦斯爆炸燒沖復(fù)合傷標(biāo)準(zhǔn)評估燒沖復(fù)合傷發(fā)生情況。管道瓦斯爆炸燒沖復(fù)合傷標(biāo)準(zhǔn)：高溫火焰、沖擊波、有害氣體中毒等綜合因素造成的實驗大鼠損傷結(jié)果，即肉眼可見的體表燒傷合并肺損傷及其他任何部位一處及多處損傷[6]。

1.3.4 2組大鼠支氣管和肺組織取材實驗組存活大鼠于爆炸實驗結(jié)束24 h，用體積分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉后處死，開胸，取右主支氣管分叉處至肺門靠近分叉處一段及右側(cè)肺組織前中葉，一部分用于大體形態(tài)觀察，一部分固定于體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋。按上述方法處死并解剖對照組大鼠，取支氣管和肺組織，常規(guī)石蠟包埋。

1.3.5 2組大鼠早期支氣管及肺損傷觀察和肺損傷程度評估觀察2組大鼠支氣管及肺表面顏色及出血情況。光鏡下觀察2組大鼠支氣管黏膜上皮有無脫落、管壁充血、水腫情況、中性粒細(xì)胞浸潤情況；肺泡壁毛細(xì)血管及肺泡間質(zhì)出血及水腫情況。判斷肺損傷程度：重度肺損傷為肺臟大片狀出血，出血總面積占全肺面積的50%以上；中度肺損傷為肺臟損傷及破裂面積在50%～10%；輕度肺損傷為肺臟呈散在的點狀出血，出血總面積小于全肺面積的l0%[7]。

1.3.6 光學(xué)顯微鏡觀察2組大鼠肺和支氣管組織病理形態(tài)取2組大鼠石蠟包埋支氣管及肺組織連續(xù) 4 μm 厚切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色；切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蒸餾水沖洗后室溫下干燥，再經(jīng)蘇木精染液及冰乙酸酒精浸染后流水沖洗，碳酸鋰飽和水溶液浸染，體積分?jǐn)?shù)5%伊紅浸染，最后梯度乙醇脫水，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.3.7 免疫組織化學(xué)染色法檢測2組大鼠支氣管及肺組織中caspase-3及caspase-9的表達(dá)取2組大鼠支氣管及肺組織石蠟包埋標(biāo)本連續(xù)4 μm厚切片，采用高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，應(yīng)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)法檢測支氣管及肺組織中caspase-3及caspase-9的表達(dá)，兔抗大鼠caspase-3及caspase-9多克隆抗體以及SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。應(yīng)用武漢塞維爾生物科技有限公司提供的陽性切片做陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作空白對照。每只大鼠觀察4張切片，上皮細(xì)胞胞質(zhì)中見清晰棕黃色、黃褐色顆粒者為陽性細(xì)胞，結(jié)果按染色強度評分[8]。染色強度評分：0分為無著色，1分為淡黃色弱著色，2分為棕黃色中等強度著色，3分為棕褐色強著色。由2名病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，光鏡下隨機(jī)觀察并記錄5個高倍視野中細(xì)胞的染色強度。無著色以-表示，弱著色、中等強度著色、強著色分別以+、++、+++表示，+、++、+++為表達(dá)陽性，計算陽性表達(dá)率，陽性表達(dá)率=陽性表達(dá)大鼠只數(shù)/總大鼠只數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瓦斯爆炸致大鼠大體損傷情況實驗組大鼠體表燒傷發(fā)生率為100.0%。69.7%大鼠體表燒傷為體毛燒傷、部分區(qū)域結(jié)痂；累及皮膚燒傷7例，為Ⅱ度燒傷，分布于頭及肢體末端、腹部、軀干等部位。30.3%大鼠體表燒傷為體毛輕度燒傷。存活大鼠均表現(xiàn)為精神差、趴臥不起、拒食、呼吸加速。

2.2 瓦斯爆炸致大鼠燒沖復(fù)合傷發(fā)生率、肺損傷發(fā)生率及死亡率燒沖復(fù)合傷及肺損傷發(fā)生率均為100.0%；大鼠共現(xiàn)場死亡19例，死亡率為19.8%，實驗結(jié)束即時死亡17例，2 h內(nèi)死亡2例。

2.3 2組大鼠支氣管及肺大體和病理形態(tài)比較結(jié)果見圖1和圖2。對照組大鼠支氣管及肺組織結(jié)構(gòu)正常，無充血水腫情況，表面未見出血點；光鏡觀察，肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔存在、腔內(nèi)有正常肺泡上皮細(xì)胞，肺泡隔內(nèi)可見結(jié)締組織細(xì)胞及毛細(xì)血管，支氣管黏膜及黏膜肌內(nèi)組織完整、無充血水腫。實驗組大鼠支氣管及肺組織顏色加深，支氣管黏膜可見散在出血灶，肺組織表面呈點狀及片狀出血灶；光鏡見肺泡間隔明顯增寬，血管充血、灶狀出血，肺泡腔內(nèi)見淡粉色水腫液。支氣管黏膜上皮細(xì)胞部分脫落，管壁充血、水腫，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜肌內(nèi)亦見大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜腺體腺腔內(nèi)分泌物增多。

A：對照組；B：實驗組。

A：對照組；B：實驗組

2.4 2組大鼠支氣管及肺組織中caspase-3、caspase-9表達(dá)比較結(jié)果見表1和圖3、圖4。2組大鼠肺組織以及支氣管組織中均有caspase-3及caspase-9表達(dá)。對照組大鼠支氣管組織中caspase-3、caspase-9陽性表達(dá)率分別為25.0%、10.0%，肺組織中caspase-3、caspase-9陽性表達(dá)率分別為30.0%、15.0%；實驗組大鼠支氣管及肺組織中caspase-3、caspase-9陽性表達(dá)率均為100.0%。實驗組大鼠支氣管組織中caspase-3、caspase-9陽性表達(dá)率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=68.310、62.986、P<0.05)；實驗組大鼠肺組織中caspase-3、caspase-9陽性表達(dá)率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=85.087、79.354,P<0.05)。

表1 2大鼠氣管及肺組織中caspase-3及caspase-9的表達(dá)比較

A：實驗組caspase-3表達(dá)；B：對照組：caspase-3表達(dá)；C：實驗組caspase-9表達(dá)；D：對照組caspase-9表達(dá)。

A：實驗組caspase-3表達(dá)；B：對照組caspase-3表達(dá)；C：實驗組caspase-9表達(dá)；D：對照組caspase-9表達(dá)。

3 討論

瓦斯爆炸傷最常見的傷害類型為燒沖復(fù)合傷[6]。燒沖復(fù)合傷是指在半封閉巷道環(huán)境中瓦斯爆炸產(chǎn)生的熱力和沖擊波導(dǎo)致的體表燒傷、沖擊傷、爆炸傷、吸入性損傷等多臟器、多部位損傷的一種內(nèi)外傷共存的創(chuàng)傷類型。燒沖復(fù)合傷具有傷情復(fù)雜、外傷掩蓋內(nèi)傷、診斷復(fù)雜以及治療相互矛盾等特點。由于瓦斯爆炸致支氣管及肺損傷的原因可能為熱力燒傷及化學(xué)刺激共同作用的結(jié)果[9]，目前關(guān)于熱力燒傷及沖擊波致肺損傷的基礎(chǔ)研究報道較多[10]，關(guān)于氣管、支氣管損傷的基礎(chǔ)研究報道較少[11]；氣管、支氣管損傷在瓦斯爆炸復(fù)合傷診療過程中亦有重要作用，但目前關(guān)于急性呼吸道阻塞窒息導(dǎo)致死亡的病理過程、氣管和支氣管損傷與呼吸衰竭的關(guān)系以及氣管插管等對呼吸道的刺激是否會增加肺部感染等仍不明確，需要進(jìn)一步研究來驗證。目前尚無瓦斯爆炸燒沖復(fù)合傷嚴(yán)重程度的評定標(biāo)準(zhǔn)，臨床醫(yī)生僅能分別依據(jù)燒傷程度、肺損傷程度及其他部位損傷情況做出臨床診斷和處理，導(dǎo)致臨床診療面臨巨大的困難。因此，構(gòu)建接近瓦斯爆炸現(xiàn)實環(huán)境的燒沖復(fù)合傷動物模型具有重要意義[12]。

本研究結(jié)果顯示，實驗組大鼠燒沖復(fù)合傷發(fā)生率為100%；體表燒傷率為100%，其69.7%為體毛燒傷、部分區(qū)域結(jié)痂，累計皮膚燒傷7只，為Ⅱ度燒傷；另30.3%為體毛輕度燒傷；肺損傷的發(fā)生率為100%；死亡19例，死亡率為19.8%。以上結(jié)果接近真實瓦斯爆炸傷事故現(xiàn)場情況，證實本管道系統(tǒng)模擬的瓦斯爆炸致燒沖復(fù)合傷動物模型穩(wěn)定可靠[13]。既往文獻(xiàn)報道，瓦斯爆炸導(dǎo)致的急性肺損傷病理形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為肺水腫，肺毛細(xì)血管明顯充血，大量炎性細(xì)胞、紅細(xì)胞浸潤[4-5,13]，但關(guān)于支氣管損傷的病理學(xué)形態(tài)相關(guān)報道較少。本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠支氣管及肺組織結(jié)構(gòu)正常，無充血水腫情況，表面未見出血點；光鏡下可見，肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔存在、腔內(nèi)有正常肺泡上皮細(xì)胞，肺泡隔內(nèi)可見結(jié)締組織細(xì)胞及毛細(xì)血管，支氣管黏膜及黏膜肌內(nèi)組織完整、無充血水腫。實驗組大鼠支氣管及肺組織顏色加深，支氣管黏膜可見散在出血灶，肺組織表面呈點狀及片狀出血灶；光鏡下可見肺泡間隔明顯增寬，血管充血、灶狀出血，肺泡腔內(nèi)見淡粉色水腫液。支氣管黏膜上皮細(xì)胞部分脫落，管壁充血、水腫，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜肌內(nèi)亦見大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜腺體腺腔內(nèi)分泌物增多；提示瓦斯爆炸傷可導(dǎo)致急性呼吸道和肺損傷，存在出血、水腫和炎癥細(xì)胞浸潤。因此，在臨床急救過程中除重視肺損傷處理以外，還應(yīng)充分注意并避免因呼吸道阻塞導(dǎo)致患者窒息死亡以及因氣管、支氣管損傷導(dǎo)致的其他臨床不利因素。

Caspase家族是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于細(xì)胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，主要位于細(xì)胞凋亡調(diào)控途徑的下游，通常以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)有致凋亡因素刺激時被激活[14-15]。Caspase-9 是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行分子[16-17]。瓦斯爆炸后產(chǎn)生的高溫、沖擊波、有害氣體等致傷因素共同作用下可導(dǎo)致氣管及肺組織出血、水腫，啟動炎癥放大效應(yīng)，大量中性粒細(xì)胞被激活后產(chǎn)生和釋放超量的活性氧族自由基，從而導(dǎo)致機(jī)體抗氧化物質(zhì)耗竭和氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基又引起線粒體損傷[15]，這些因素共同作用可能激活凋亡起始分子caspase-9，進(jìn)而激活下游的凋亡執(zhí)行分子caspase-3，繼而誘導(dǎo)氣管、支氣管及肺組織細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，2組大鼠肺組織及支氣管組織中均有caspase-3及caspase-9的表達(dá)，實驗組大鼠支氣管和肺組織中caspase-3及caspase-9陽性表達(dá)率顯著高于對照組。提示細(xì)胞凋亡可能是瓦斯爆炸傷燒沖復(fù)合傷中支氣管、肺損傷的關(guān)鍵病理生理機(jī)制之一[19]。

綜上所述，本管道系統(tǒng)模擬的瓦斯爆炸燒沖復(fù)合傷動物模型與實際瓦斯爆炸現(xiàn)場情況相似，且條件易于控制，重復(fù)性佳，可以達(dá)到科學(xué)研究要求。但仍需探索設(shè)計不同瓦斯?jié)舛群腿萘康墓艿老到y(tǒng)，以達(dá)到精準(zhǔn)控制氣體濃度及爆炸條件，尋找基于炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體凋亡、自噬、焦亡等損傷機(jī)制和干細(xì)胞及其外泌體修復(fù)的作用靶標(biāo)[20-23]，以期為煤礦瓦斯爆炸傷害院前急救護(hù)理及臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。