張建珍 ，史學(xué)凱，李帥，楊霖，柴林，朱坤炎

（1.山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；3.堪薩斯州立大學(xué)，美國(guó) 曼哈頓 堪薩斯州 66506）

0 引言

1990年，Napoli和Jorgensen在研究植物花色過(guò)程中，首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcrip?tional gene silencing，PTGS）現(xiàn)象［1］。Fire等在秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elagans）及真菌中相繼報(bào)道這一現(xiàn)象，并將此現(xiàn)象定義為RNA干擾（RNA interference，RNAi）［2-3］，是指雙鏈 RNA 特異性降解靶標(biāo)基因mRNA序列的過(guò)程［3］。

RNAi主要包含三種通路，分別為short/small interfering RNAs（siRNAs）介導(dǎo)的siRNA通路、microRNAs（miRNAs）介導(dǎo)的miRNA通路和P-element induced wimpy tesis（Piwi）-interacting RNAs（PiRNAs）介導(dǎo)的piRNA通路。其中，siRNA介導(dǎo)的基因沉默在昆蟲(chóng)基因功能研究及害蟲(chóng)防治中都起著舉足輕重的作用，其作用機(jī)制為外源或內(nèi)源產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈dsRNA進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中核酸內(nèi)切酶Dicer2的作用及R2D2和Loqs的輔助下，切割成大小為21 nt～23 nt的雙鏈siRNA，其中5′端含有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3′端含有一個(gè)羥基并突出2 nt懸垂，這種結(jié)構(gòu)是提高 RNAi效 應(yīng) 所 必 需 的［4-5］。 siRNA 與 Ago?naute2（Ago2），以及用于形成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA induced silencing complex，RISC）的相關(guān)蛋白（RISC-associated proteins，RP）結(jié)合，形成RISC。在ATP供能的條件下，RISC將雙鏈siRNA解開(kāi)，正義鏈被迅速降解，反義鏈siRNA與Ago2等蛋白結(jié)合形成有活性的RISC，在反義鏈的引導(dǎo)下，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別靶標(biāo)mRNA序列，在Ago2的作用下裂解靶標(biāo)mRNA，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因的快速及持續(xù)性沉默［6］。siRNA的作用過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 siRNA介導(dǎo)的RNAi通路示意圖Fig.1 Model of siRNA-mediated RNAi pathway

由于RNAi技術(shù)的特異性、高效性、對(duì)環(huán)境無(wú)污染及相對(duì)安全等優(yōu)點(diǎn)，引起生物學(xué)家廣泛關(guān)注，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，該技術(shù)迅速向基因治療及害蟲(chóng)防治領(lǐng)域拓展［7-8］。目前，科學(xué)家們致力于研發(fā)更多靶向害蟲(chóng)防治的dsRNA生物制劑，并將基于RNAi的害蟲(chóng)防治生物制劑稱為“第四代殺蟲(chóng)劑”。

1 dsRNA吸收機(jī)制

外源dsRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的首要環(huán)節(jié)是被組織細(xì)胞吸收，昆蟲(chóng)細(xì)胞吸收dsRNA的效率是決定RNAi效率的關(guān)鍵限速步驟［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)體內(nèi)dsRNA吸收存在兩大類信號(hào)通路，分別為SID跨膜通道蛋白介導(dǎo)的通路和真核細(xì)胞的胞吞作用途徑（圖2和圖3）。

圖2 SID跨膜通道介導(dǎo)的dsRNA吸收示意圖Fig.2 Model of SID mediated dsRNAuptake pathways

圖3 胞吞介導(dǎo)的dsRNA吸收示意圖Fig.3 Model of endocytosis mediated dsRNAuptake pathways

1.1 SID跨膜通道介導(dǎo)的吸收

Winston等在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性RNA干擾缺陷基因1（systemic RNA interference defective 1，sid?1），該基因是體內(nèi)細(xì)胞輸入RNAi沉默信號(hào)及組織間傳遞所必需的［11］。隨后，陸續(xù)在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn) sid?2、sid?3、sid?5。sid?2在線蟲(chóng)腸腔膜上特異表達(dá)，介導(dǎo)dsRNA內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞［12］；sid?3作為一種酪氨酸激酶，負(fù)責(zé)磷酸化dsRNA吸收通路相關(guān)蛋白，有助于dsRNA的吸收［13］；sid?5主要定位于內(nèi)體，負(fù)責(zé)RNAi沉默信號(hào)的輸出［14］。

近年來(lái)，科學(xué)家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)中也存在sid?1同源基因（被稱為sid?1 like基因），并對(duì)其功能展開(kāi)研究，研究發(fā)現(xiàn)不同昆蟲(chóng)sid?1 like基因功能存在差異。例如鞘翅目馬鈴薯甲蟲(chóng)（Leptinotarsa decemlineata）和玉米根螢葉甲（Di?abrotica virgifera virgifera），半翅目褐飛虱（Nilaparvata lugens）和 豌 豆 蚜（Acyrthosiphon pisum），膜翅目西方蜜蜂（Apis mellifera）中均存在sid?1 like基因，在dsRNA吸收過(guò)程中發(fā)揮作用；相反，雖然鞘翅目赤擬谷盜（Tribolium casta?neum），直翅目沙漠蝗（Schistocerca gregaria），鱗翅目家蠶（Bombyx mori）體內(nèi)可表達(dá) sid?1 like基因，但其并不參與dsRNA吸收［14-21］。果蠅（Drosophila sp.）中并不存在 sid?1 like基因，但將果蠅S2細(xì)胞浸泡于含有dsRNA的培養(yǎng)基中，仍能引起 S2細(xì)胞 RNAi效應(yīng)［22］，這表明，昆蟲(chóng)體內(nèi)可能存在另一種dsRNA吸收機(jī)制。

1.2 胞吞作用

胞吞作用是真核細(xì)胞的正常生理過(guò)程，負(fù)責(zé)將胞外物質(zhì)吞入胞內(nèi)，主要參與生物體免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織代謝平衡等，對(duì)生物正?；顒?dòng)起重要作用［23］。研究表明，dsRNA可通過(guò)細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入昆蟲(chóng)細(xì)胞［21］。細(xì)胞中存在多途徑的胞吞方式，依據(jù)其胞吞囊泡大小及作用蛋白不同，可大致分為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞、大型胞飲依賴的內(nèi)吞、吞噬作用依賴的內(nèi)吞及其他類型的內(nèi)吞通路（表1）。

表1 細(xì)胞不同內(nèi)吞通路特征及相關(guān)抑制劑Table 1 Characteristics of different endocytosis pathways and related inhibitors

1.2.1 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通路研究得最為深入，該通路負(fù)責(zé)內(nèi)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗原、生長(zhǎng)因子、可溶性大分子和病毒等［24］。參與該途徑的作用蛋白主要為網(wǎng)格蛋白和其輔助蛋白（adap?tor protein 2（AP2）和 β-arrestin）等，其內(nèi)吞過(guò)程中形成網(wǎng)格蛋白有被小窩（clathrin-coated pit，CCP），直徑約100 nm，隨后形成網(wǎng)格蛋白有被小泡（clathrin-coated vesicle，CCV），將物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。

氯丙嗪（chlorpromazine，CPZ）可阻斷網(wǎng)格蛋白在細(xì)胞膜處的組裝，特異性抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通路。Saleh等通過(guò)基因組篩選，生化手段及藥理實(shí)驗(yàn)（CPZ處理）發(fā)現(xiàn)果蠅S2細(xì)胞通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式吸收外源dsRNA［22］。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者利用藥理手段和RNAi of RNAi技術(shù)，分別發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜，馬鈴薯甲蟲(chóng)，沙漠蝗，豌豆蚜和埃及伊蚊（Aedes ae?gypti）等昆蟲(chóng)類群可同樣利用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑內(nèi)化外源 dsRNA［17，21，25-27］。

1.2.2 小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞

小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用在哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞中研究得較為透徹，該途徑主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)體、納米顆粒及血清蛋白等［28-29］。參與該途徑的作用蛋白主要為小窩蛋白。此外，脂筏對(duì)其內(nèi)吞通路的形成至關(guān)重要。在內(nèi)吞過(guò)程中，胞外配體與細(xì)胞膜處受體結(jié)合，在小窩蛋白作用下質(zhì)膜內(nèi)陷形成直徑約50 nm～100 nm的小窩結(jié)構(gòu)；小窩形成后，從質(zhì)膜處分離進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［29］。

染料木素（genistein）、甲基-β-環(huán)糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）、非律平（filipin）和制霉菌素（nystatin）是該通路較為常用的抑制劑，這些抑制劑通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或移除細(xì)胞膜表面的膽固醇，破壞細(xì)胞膜上小窩的形成，從而阻斷內(nèi)吞路徑。在赤擬谷盜和埃及伊蚊中，內(nèi)化dsRNA均不依賴小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞［25，30］，dsRNA 是否可通過(guò)該途徑內(nèi)化進(jìn)入昆蟲(chóng)細(xì)胞尚有待進(jìn)一步研究。

1.2.3 大型胞飲依賴的內(nèi)吞

大型胞飲是真核細(xì)胞最古老的內(nèi)吞方式，主要在轉(zhuǎn)運(yùn)體積較大的液泡時(shí)發(fā)揮作用，肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞分裂周期蛋白（Cdc42）和Pak-1等調(diào)節(jié)因子參與其中。在胞飲過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)膜延伸擴(kuò)張，將胞外液體包裹，形成直徑大于0.2 μm的囊泡，隨后形成約5 μm～10 μm的大型胞飲體，與質(zhì)膜分離進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［31］。

5-（N-乙基-N-丙基）阿米洛利（5-（N-ethyI-N-isopropyI）amiloride，EIPA），Ly294002和細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D，CCD）可有效抑制大型胞飲依賴的內(nèi)吞。EIPA通過(guò)阻斷細(xì)胞膜處的Na+/H+交換過(guò)程，可有效抑制大型胞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程［32］；PI3K是完成大型胞飲作用所必需的，LY294002可通過(guò)阻斷PI3K活性來(lái)減弱大型胞飲依賴的內(nèi)吞［33］；CCD可破壞肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有效抑制大型胞飲的發(fā)生［25］。Gillet等通過(guò)熒光Cy3標(biāo)記dsRNA，并與嵌合蛋白PTD-DRBD結(jié)合，形成核糖核蛋白粒子（ribonucleoprotein particle，RNP），利用熒光顯微追蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，核糖核蛋白粒子通過(guò)大型胞飲依賴的內(nèi)吞作用進(jìn)入棉鈴象甲（Anthonomus grandis）中腸細(xì)胞［34］。

1.2.4 吞噬作用

吞噬作用主要存在于免疫組織中，通過(guò)吸收胞外大于0.5 μm的大顆粒物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)降解，從而對(duì)細(xì)胞外環(huán)境進(jìn)行免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)格蛋白和肌動(dòng)蛋白等因子在吞噬過(guò)程起重要作用。類似于其他內(nèi)吞路徑，胞外配體與吞噬作用相關(guān)膜受體結(jié)合，激活細(xì)胞膜處一系列內(nèi)化信號(hào)，轉(zhuǎn)運(yùn)胞外物質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)吞噬體［35］。

氯喹（chloroquine，CLQ）通過(guò)降低溶酶體酸性從而抑制吞噬作用的發(fā)生，是該途徑的抑制劑之一，該抑制劑在病毒侵染細(xì)胞的研究中廣為應(yīng)用［36］，但在昆蟲(chóng)dsRNA吸收機(jī)制研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。Rocha等使用大腸桿菌表達(dá)dsRNA，利用RNAi of RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌表達(dá)dsRNA依賴吞噬作用進(jìn)入果蠅S2細(xì)胞［37］。

1.2.5 其他內(nèi)吞通路

細(xì)胞中還存在其他內(nèi)吞通路，如flotillin依賴的內(nèi)吞、Arf6依賴的內(nèi)吞、GRAF1依賴的內(nèi)吞和RhoA依賴的內(nèi)吞。這幾種細(xì)胞內(nèi)吞路徑的研究報(bào)道較少，其吸收機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。迄今為止，dsRNA是否可利用這些內(nèi)吞方式入胞尚未見(jiàn)報(bào)道。

2 不同昆蟲(chóng)吸收dsRNA機(jī)制存在差異

不同昆蟲(chóng)類群間dsRNA吸收機(jī)制存在差異，且同一種昆蟲(chóng)存在多種內(nèi)化dsRNA的途徑（表2）。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用較為常見(jiàn)，SID介導(dǎo)的吸收機(jī)制也有報(bào)道，但研究手段較為單一，主要是通過(guò)RNAi of RNAi技術(shù)。不同種昆蟲(chóng)RNAi效率存在較大差異，例如鞘翅目（如玉米根螢葉甲，馬鈴薯甲蟲(chóng)）和直翅目（如飛蝗Locusta migratoria）等昆蟲(chóng)，RNAi效率較高，相反，雙翅目（如果蠅）和鱗翅目（如歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis，斜紋夜蛾Spodoptera litu?ra）等昆蟲(chóng) RNAi效率卻很低［39-44］。是否昆蟲(chóng)間RNAi效率差異與dsRNA吸收機(jī)制差異存在關(guān)聯(lián)？這些問(wèn)題饒有興趣，值得深入探究。

表2 昆蟲(chóng)dsRNA吸收通路研究概覽Table 2 Overview of dsRNAuptake pathways in insects

3 影響昆蟲(chóng)dsRNA吸收效率的制約因素及應(yīng)對(duì)策略

不同種昆蟲(chóng)RNAi敏感性不同，揭示影響dsRNA吸收的關(guān)鍵因素，從而提出相應(yīng)解決對(duì)策，有望改善昆蟲(chóng)細(xì)胞對(duì)dsRNA的吸收效率，從而提高RNAi效率，加速dsRNA生物農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。

3.1 影響昆蟲(chóng)dsRNA吸收效率的因素

3.1.1 dsRNA片段長(zhǎng)度對(duì)吸收效率的影響

dsRNA片段長(zhǎng)度可以影響細(xì)胞吸收效率。Shale等選用不同長(zhǎng)度dsRNA（21 bp～592 bp）處理果蠅S2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度dsRNA對(duì)靶基因RNAi效率存在顯著差異，dsRNA片段越長(zhǎng)RNAi效率越高［22］，肖達(dá)等也研究了不同長(zhǎng)度dsRNA（50 bp～799 bp）對(duì)赤擬谷盜靶標(biāo)基因沉默效率的影響，發(fā)現(xiàn)片段較長(zhǎng)的dsRNA（799，396，200 bp）沉 默 效 率 顯 著 高 于 50 bp的dsRNA，因此認(rèn)為長(zhǎng)片段dsRNA吸收效率高于短片段dsRNA［45］。韓召軍等通過(guò)體外培養(yǎng)赤擬谷盜中腸，孵育一定不同長(zhǎng)度的dsRNA，隨后定量檢測(cè)中腸細(xì)胞內(nèi)不同長(zhǎng)度dsRNA（21 bp～480 bp）的含量，發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度dsRNA吸收效率由高到低依次為480 bp>240 bp>120 bp=60 bp>21 bp［46］，結(jié) 果 與 前 者 一 致 。 這 表 明dsRNA片段越長(zhǎng)，越容易被細(xì)胞吸收，吸收效率越高。

3.1.2 dsRNA結(jié)構(gòu)對(duì)吸收效率的影響

隨著對(duì)dsRNA吸收機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)設(shè)計(jì)dsRNA結(jié)構(gòu)可有效提高dsRNA的穩(wěn)定性及RNAi效率。Abbasi等設(shè)計(jì)了一個(gè)新型的 paperclip dsRNA（23 bp），paperclip dsRNA 的兩端均設(shè)計(jì)有閉環(huán)結(jié)構(gòu)，但這個(gè)閉環(huán)并不是共價(jià)偶聯(lián)。paperclip dsRNA可通過(guò)不依賴于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入埃及伊蚊細(xì)胞內(nèi)，RNAi效率顯著提高［30］。在昆蟲(chóng)中（例如果蠅，玉米根螢葉甲，赤擬谷盜等），片段較短的dsRNA（短于 50 bp）不能被細(xì)胞吸收［22，46-47］；然而，埃及伊蚊細(xì)胞可高效吸收帶有環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)的dsRNA（23 bp），并發(fā)揮RNAi作用。這種環(huán)狀dsRNA進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制尚有待進(jìn)一步探究。

3.1.3 昆蟲(chóng)腸液及血腔的pH環(huán)境及核酸酶對(duì)吸收效率的影響

研究表明，dsRNA在昆蟲(chóng)腸液或血腔的持續(xù)性和穩(wěn)定性與細(xì)胞吸收dsRNA數(shù)量密切相關(guān)。不同昆蟲(chóng)類群血淋巴pH維持在6.4～7.5之間，然而腸液pH卻存在很大差異。鱗翅目昆蟲(chóng)腸液pH為11～12，由于dsRNA在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，導(dǎo)致其在腸液中被水解，腸上皮細(xì)胞無(wú)法有效吸收完整的dsRNA，這是鱗翅目昆蟲(chóng)對(duì)RNAi不敏感的關(guān)鍵因素之一［48］。

另外，多種昆蟲(chóng)（例如棉鈴象甲，飛蝗，家蠶，斜紋夜蛾，沙漠蝗，煙粉虱（Bemisia tabaci）和玉米螟等）體內(nèi)存在dsRNA降解酶（dsRNA-degrading enzymes，dsRNases）和核酸酶 REase，均可快速降解腸液或血腔中的dsRNA，導(dǎo)致昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)法攝入完整的dsRNA，導(dǎo)致RNAi效率極低［41，49-54］。

3.2 提高昆蟲(chóng)dsRNA吸收效率的策略

細(xì)胞對(duì)dsRNA的吸收效率是影響RNAi效率的主要限速步驟，提高dsRNA在昆蟲(chóng)體內(nèi)的完整性及細(xì)胞吸收效率可有效提高RNAi效率。

3.2.1 納米材料介導(dǎo)dsRNA遞送

部分納米顆粒通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的核酸進(jìn)行結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合體，可免受昆蟲(chóng)腸液和血液的降解，并通過(guò)內(nèi)吞方式進(jìn)入昆蟲(chóng)細(xì)胞。例如Zhang等利用殼聚糖包裹dsRNA，形成殼聚糖-dsRNA復(fù)合物，有效提高岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）對(duì)dsRNA的吸收，RNAi效率顯著提升［55］。另外，Xu等報(bào)道苝酰亞胺（perylene diimides，PDI）熒光納米載體包裹dsRNA可迅速進(jìn)入離體培養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）活體組織，顯示出較高的組織吸收率［56］；沈杰等利用陽(yáng)離子核-殼熒光納米材料（FNP）遞送dsRNA，隨后噴灑于蚜蟲(chóng)（Aphis glycines）表皮處，納米載體在1 h內(nèi)迅速通過(guò)表皮進(jìn)入血腔［57］。納米材料在dsRNA遞送過(guò)程的成功應(yīng)用，促進(jìn)了dsRNA核酸農(nóng)藥在RNAi不敏感昆蟲(chóng)中的基因功能研究及田間蟲(chóng)害防控。

3.2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)dsRNA遞送

除納米材料外，脂質(zhì)體由于其無(wú)毒性及易降解性等優(yōu)點(diǎn)，備受研究學(xué)者的青睞。脂質(zhì)體可攜帶dsRNA穿透昆蟲(chóng)細(xì)胞膜磷脂雙分子層，在昆蟲(chóng)基因功能研究中被廣泛應(yīng)用。Taning等發(fā)現(xiàn)Lipofectamine 2000可有效遞送dsRNA，導(dǎo)致櫻桃果蠅（Drosophila suzukii）靶基因沉默，死亡率顯著提高［58］；Zhang等選用3種脂質(zhì)體（Li?pofectamine 2000，DMRIE-C 和 Cellfectin）遞 送dsRNA，發(fā)現(xiàn)鐮形扇頭蜱（Rhipicephalus haema?physaloides）RNAi效率顯著提高，用帶有熒光信號(hào)的dsRNA可視化觀察其吸收情況，結(jié)果表明，脂質(zhì)體包裹的dsRNA可快速穿透蜱蟲(chóng)表皮進(jìn)入體內(nèi)，體內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)；相反，裸露的dsRNA熒光信號(hào)微弱，說(shuō)明脂質(zhì)體可高效遞送dsRNA［59］。由于脂質(zhì)體成本較高，尚未在田間應(yīng)用。

3.2.3 微生物介導(dǎo)dsRNA遞送

常見(jiàn)的微生物遞送dsRNA載體包括病毒、細(xì)菌、真菌、共生菌和酵母。研究表明，微生物介導(dǎo)dsRNA遞送系統(tǒng)可有效促進(jìn)昆蟲(chóng)細(xì)胞對(duì)dsRNA的吸收，提高RNAi效率。例如橘小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）、煙粉虱和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）均可通過(guò)細(xì)菌表達(dá)dsRNA系統(tǒng)，致使靶基因沉默效率大幅提升，蟲(chóng)體死亡 率顯 著 提 高［60-62］；家蠶 對(duì) RNAi不 敏感 ，Uhlirova等選用病毒介導(dǎo)dsRNA侵染家蠶，成功導(dǎo)致靶基因的表達(dá)顯著下調(diào)，造成化蛹異常，成蟲(chóng)形態(tài)缺陷［63］；夏玉先等通過(guò)真菌表達(dá)dsRNA處理飛蝗，致其死亡率可顯著提高［64］；Dyson等報(bào)道共生菌表達(dá)dsRNA，處理西花薊馬（Frankliniella occidentalis）和長(zhǎng)紅錐蝽（Rhod?nius prolixus），導(dǎo)致這兩種昆蟲(chóng)死亡率顯著提高［65］；Mysore等對(duì)岡比亞按蚊喂食表達(dá)有shR?NA的釀酒酵母，其幼蟲(chóng)靶基因顯著下調(diào)，出現(xiàn)100%死亡率［66］。由于微生物介導(dǎo)dsRNA遞送系統(tǒng)成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，植物保護(hù)領(lǐng)域?qū)W者已著手將其應(yīng)用于農(nóng)田害蟲(chóng)防治，可以預(yù)期，該技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景。

3.2.4 設(shè)計(jì)dsRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

對(duì)原有dsRNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造可有效提高其在蟲(chóng)體內(nèi)穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞吸收dsRNA。僅有Abbasi等報(bào)道對(duì)dsRNA結(jié)構(gòu)的改造，埃及伊蚊細(xì)胞可高效吸收帶有環(huán)狀的dsRNA，RNAi效率顯著提高［30］。關(guān)于dsRNA結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)有待進(jìn)一步的探究。

4 結(jié)論與展望

農(nóng)田害蟲(chóng)對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥抗藥性日趨嚴(yán)重，農(nóng)藥殘留、病蟲(chóng)害防效下降給食品安全、生態(tài)環(huán)境和人類健康造成重大影響，同時(shí)給作物優(yōu)質(zhì)增產(chǎn)帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。采用RNAi技術(shù)制備核酸農(nóng)藥，是植保領(lǐng)域新興顛覆性前沿技術(shù)和重要發(fā)展方向，是國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥行業(yè)的前沿?zé)狳c(diǎn)，有望成為“第四代新型殺蟲(chóng)劑”。然而，昆蟲(chóng)吸收dsRNA效率制約RNAi技術(shù)的應(yīng)用，成為害蟲(chóng)防治的一大障礙。因此，揭示不同昆蟲(chóng)dsRNA吸收機(jī)制，靶向設(shè)計(jì)dsRNA遞送載體，提高dsRNA在蟲(chóng)體的穩(wěn)定性，克服昆蟲(chóng)細(xì)胞吸收dsRNA瓶頸，高效遞送dsRNA進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，將大大促進(jìn)核酸農(nóng)藥在農(nóng)田中的廣泛應(yīng)用。