王煜，高文英

（山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

亞硫酸氫鹽（HSO3?）作為主要的大氣污染物SO2的衍生物，對(duì)人體健康及生態(tài)系統(tǒng)都有較大的影響［1-3］。研究表明，體內(nèi)過(guò)量的亞硫酸氫鹽會(huì)對(duì)組織和細(xì)胞造成不可逆的損傷，誘發(fā)呼吸道疾病、心腦血管疾病和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病［4-7］。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織共同提出人體內(nèi)亞硫酸氫鹽水平應(yīng)低于0.7 mg/kg［8］。鑒于亞硫酸氫鹽被廣泛用作漂白劑，染料、造紙、皮革制造中的還原劑以及食品防腐劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑［9-12］，開(kāi)發(fā)有效的分析方法對(duì)食品和環(huán)境中HSO3?的檢測(cè)至關(guān)重要。

在對(duì)亞硫酸氫鹽的檢測(cè)中，傳統(tǒng)的電化學(xué)法［13-14］、高效液相色譜法［15］、毛細(xì)管電泳［16］、化學(xué)發(fā)光法［17］等方法存在操作復(fù)雜、靈敏度低以及費(fèi)用較高等問(wèn)題。相比之下，熒光探針因具有響應(yīng)速度快、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、生物成像應(yīng)用方便、可實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)［18-20］而受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道了不少基于配位作用［21］、對(duì)醛的親核加成［22］、邁克爾加成［23-26］、乙酰丙酸酯分解［27-28］等反應(yīng)機(jī)理的HSO3?熒光探針，但仍然存在探針結(jié)構(gòu)復(fù)雜、水溶液中無(wú)法檢測(cè)、響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低以及無(wú)法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)生物成像等問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)性能優(yōu)良的熒光探針用于HSO3?的檢測(cè)仍具有很大的發(fā)展空間。

本文以3-芐基-2甲基苯并噻唑溴化鹽和3，4-二羥基苯甲醛為原料合成了熒光探針BDT，其中鄰苯二酚基團(tuán)和苯并噻唑鹽通過(guò)C=C雙鍵共軛連接成一個(gè)大的π-共軛體系，且具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）特性。帶正電荷的苯并噻唑部分作為邁克爾加成的反應(yīng)位點(diǎn)，還可以增加探針的水溶性。HSO3?與BDT發(fā)生加成反應(yīng)，破壞了探針?lè)肿拥摩?共軛體系，阻斷ICT過(guò)程，引起溶液顏色及熒光發(fā)射波長(zhǎng)的顯著改變，從而可實(shí)現(xiàn)在水體系中比色/比率檢測(cè)HSO3?。探針BDT對(duì)HSO3?表現(xiàn)出高選擇性、高靈敏度。此外，BDT對(duì)HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性HSO3?具有良好的熒光成像能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2450，島津，日本）；熒光分光光度計(jì)（F-4600，日立，日本），激發(fā)波長(zhǎng)分別為300 nm和533 nm，Ex/Em狹縫寬度為10 nm；核磁共振儀（AVANCEIIIHD-600，Bruker，德 國(guó) ）；高 分 辨 質(zhì) 譜 儀（Bruker mi?crOTOF-Q III）；酸度計(jì)（pH-FE20，梅特勒-托利多，上海精密儀器公司）；共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM-880，德國(guó)）。

2-甲基苯并咪唑、3，4-二羥基苯甲醛（98%，上海阿拉丁生化科技有限公司），溴化芐（98%，上海麥克林生化科技有限公司），實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。所用其他試劑均為分析純。

1.2 探針BDT的合成及結(jié)構(gòu)表征

探針BDT的合成路線如圖1所示。3-芐基-2甲基苯并噻唑溴化鹽按照文獻(xiàn)［29］報(bào)道方法合成。將 0.5 mmol（0.16 g）3-芐基-2甲基苯并噻唑溴化鹽與 0.5 mmol（0.069 g）3，4-二羥基苯甲醛溶于7 mL乙醇中，固體充分溶解后加入2滴哌啶，在N2保護(hù)下加熱回流10 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫并放入冰箱冷凍24 h，抽濾得到紅褐色固體產(chǎn)物（BDT）。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：10.445 7（1H，s），9.381 4（1H，s），7.473 2（1H，s），8.109 7（1H，d），6.889 8（1H，d），7.881 2（1H，d），8.164 5（1H，d），7.779 6（1H，t），7.731 8（1H，t），8.421 1（1H，d），6.224 9（2H，s），7.395 5（6H，m）。13C NMR（600 MHz，DMSO-d6）：173.38，152.16， 151.63， 146.53， 141.71， 134.52，129.85， 129.61， 128.89， 128.58， 128.19，127.30， 126.37， 125.41， 124.87， 117.09，116.94，116.48，109.85，56.48，51.51，19.03。HRMS（ESI）：calcd.for C22H18NO2S+（M-Br?）360.105 3，found 360.104 6。

圖1 BDT的合成路線圖Fig.1 Synthesis of BDT

1.3 光譜研究方法

探針 BDT（1×10?3mol·L?1）和陰離子儲(chǔ)備液（1×10?2mol·L?1）分別用DMSO和二次蒸餾水配制。在比色管中加入一定量的探針儲(chǔ)備液和一定量的陰離子儲(chǔ)備液，而后加入100 μL HEPES緩沖溶液（pH=7.4），使用二次蒸餾水定容至5 mL，混合均勻，進(jìn)行相應(yīng)的紫外或熒光光譜測(cè)定。紫外及熒光測(cè)定中探針的濃度分別為 20 μmol·L?1及 8 μmol·L?1。

1.4 實(shí)際樣品中HSO3?的檢測(cè)

白糖、白酒均購(gòu)自山西大學(xué)文瀛超市，于比色管中分別加入0.5 g白糖和100 μL白酒，用二次蒸餾水定容至5 mL作為待測(cè)溶液，加入探針 BDT（8 μmol·L?1）后測(cè)定熒光發(fā)射光譜，并采用標(biāo)準(zhǔn)加入回收法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞成像

將HeLa細(xì)胞在37℃，含5% CO2的環(huán)境中用 10%（V/V）胎 牛 血 清（FBS，Gibco）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在成像實(shí)驗(yàn)中，首先將細(xì)胞與 BDT（10 μmol·L?1）在細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育20 min，然后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗3次，以消除未進(jìn)入細(xì)胞的探針BDT。在共聚焦顯微鏡下成像。之后，繼續(xù)加入HSO3?（20 μmol·L?1）共同孵育，PBS 沖洗 3 次后，使用63倍物鏡進(jìn)行細(xì)胞成像。在內(nèi)源性HSO3?的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，兩組HeLa細(xì)胞分別用BDT和BDT+Cys共同孵育30 min，用PBS洗滌3次后進(jìn)行成像。激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm和488 nm，發(fā)射光譜波長(zhǎng)范圍分別為410 nm～481 nm和500 nm～601 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSO3?對(duì)BDT紫外吸收光譜的影響

BDT的光譜測(cè)試在H2O體系（25 mmol·L?1HEPES緩沖溶液，pH 7.4）中進(jìn)行。圖 2（a）為BDT在水體系中加入HSO3?前后紫外吸收光譜的變化。BDT本身在534 nm處有較強(qiáng)的吸收，該吸收峰由鄰苯二酚基團(tuán)到苯并噻唑鹽的ICT過(guò)程產(chǎn)生。隨著HSO3?的逐量加入，由于二者發(fā)生親核加成反應(yīng)后，阻礙了分子的π-π共軛及ICT效應(yīng)，使534 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸減弱，279 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸增加，且在305 nm處出現(xiàn)了一個(gè)等吸收點(diǎn)，表明反應(yīng)中形成了新的穩(wěn)定化合物。同時(shí)，溶液的顏色由紫紅色變?yōu)闊o(wú)色。圖2（b）表明，吸光度比A534nm/A279nm與HSO3?濃度在0～1×10?5mol·L?1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于對(duì)HSO3?濃度的定量檢測(cè)。

圖2 （a）不同濃度HSO3?（0～2 equiv）存在下BDT（2×10?5mol·L?1）的紫外吸收光譜。插圖：日光燈下BDT溶液的顏色變化；（b）BDT的吸光度比A534 nm/A279 nm隨［HSO3?］的變化Fig.2 (a)Uv-vis absorption spectra of BDT(2×10?5mol·L?1)with the incremental concentration of HSO3? (0-2 equiv.).Inset:The color change of BDT solution under daylight;(b)Curve of absorbance ratio(A534 nm/A279 nm)vs[HSO3?]

圖 3（a）為常見(jiàn)陰離子（F?，Cl?，Br?，I?，HSO4?，SO42?，AcO?，NO3?，H2PO4?，HSO3?，CN?，S2?，HCO3?，CO32?，ClO?，H2O2，C2O42?，S2O32?，Cys，Hcy，GSH）與 BDT 作用后紫外吸收光譜的變化情況，結(jié)果顯示，只有HSO3?能夠使BDT的吸收光譜和溶液顏色發(fā)生顯著變化。此外，共存離子不會(huì)對(duì)BDT-HSO3?的吸光度值造成影響（圖3（b））。表明BDT對(duì)HSO3?具有高選擇性識(shí)別能力，可用于對(duì)HSO3-的可視化識(shí)別檢測(cè)。

圖3 （a）不同陰離子（1×10?4mol·L?1）對(duì)探針BDT（2×10?5mol·L?1）紫外吸收光譜的影響；（b）在HSO3? 存在下添加干擾離子后，BDT（2×10?5mol·L?1）的吸光度比（A534 nm/A279 nm）Fig.3 （a）Uv-vis absorption spectra of BDT（2×10?5mol·L?1）after addition of various anions（1×10?4mol·L?1）；（b）The absorbance ratio（A534 nm/A279 nm）of BDT（2×10?5mol·L?1）after adding interfering ions in the presence of HSO3?

2.2 HSO3?對(duì)BDT熒光光譜的影響

通過(guò)熒光發(fā)射光譜考察了探針與HSO3?的相互作用。如圖4所示，分別以300 nm和533 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，探針BDT的熒光光譜在337 nm和590 nm處呈現(xiàn)發(fā)射峰。隨著HSO3?濃度的增加，337 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而590 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，顯示出良好的比率檢測(cè)性能。圖 4（c）顯示，在 0～1.2×10?5mol·L?1范圍內(nèi)，BDT檢測(cè)HSO3?顯示出良好的線性關(guān)系，根據(jù)方程3σ/S，計(jì)算得到檢出限為2.86×10?7mol·L?1，低于我國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的食品中HSO3?的最大允許值（1.56×10?3mol·L?1）［30］。此外，對(duì)濃度為 4×10?5mol·L-1的 HSO3?進(jìn)行 6次平行測(cè)定，計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.94%，表明探針BDT對(duì)HSO3?的熒光響應(yīng)重復(fù)性和精密度良好。

圖4 BDT熒光光譜隨HSO3?濃度的變化，（a）λex=533 nm；（b）λex=300 nm；（c）校準(zhǔn)曲線Fig.4 Change in fluorescence spectrum of BDT with HSO3? concentration，（a）λex=533 nm；（b）λex=300 nm；（c）Calibration curve

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了BDT對(duì)HSO3?的選擇性及抗干擾能力。如圖5（a）所示，除HSO3?外，其他陰離子均不能使探針BDT在590 nm處的熒光強(qiáng)度降低。此外，共存離子（4×10?5mol·L?1）的加入并不會(huì)對(duì) BDT 檢測(cè) HSO3?的熒光響應(yīng)產(chǎn)生影響（圖5（b））。以上結(jié)果表明，探針BDT在水體系中能夠?qū)SO3?進(jìn)行特異性識(shí)別檢測(cè)，是一種在復(fù)雜環(huán)境中具有潛在應(yīng)用價(jià)值的HSO3?熒光探針。

圖5 （a）不同陰離子（4×10?5mol·L?1）對(duì)探針BDT（8×10?6mol·L?1）熒光光譜的影響；（b）在HSO3?存在下添加干擾離子（4×10?5mol·L?1）后，BDT（8×10?5mol·L?1）的熒光強(qiáng)度比（F590 nm/F337 nm）Fig.5 （a）Fluorescence spectra of BDT（8×10?6mol·L?1）after addition of various anions（4×10?5mol·L?1）；（b）the fluorescence intensity ratio（F590 nm/F337 nm）of BDT（8×10?5mol·L?1）after adding interfering ions（4×10?5mol·L?1）in the presence of HSO3?

為了探究探針BDT檢測(cè)HSO3?的實(shí)用性，考察了pH對(duì)BDT及BDT-HSO3?熒光光譜的影響。如圖6（a）所示，當(dāng)pH為7～8時(shí)，BDT對(duì)HSO3?有較好的光譜響應(yīng)，因此選擇pH 7.4進(jìn)行光譜測(cè)試。隨后，探究了BDT-HSO3?熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況（圖6（b）），可以發(fā)現(xiàn)，HSO3?的加入使BDT在590 nm處的熒光強(qiáng)度迅速降低，180 s達(dá)到平衡。上述結(jié)果表明，探針BDT能夠?qū)崿F(xiàn)在生理pH值下快速檢測(cè)HSO3?。

圖6 （a）pH對(duì)BDT和BDT-HSO3? 處熒光強(qiáng)度的影響；（b）BDT-HSO3?熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。（［BDT］=8×10?6 mol·L?1，［HSO3?］=4×10?5mol·L?1）Fig.6 （a）Effect of pH on the fluorescence intensity of BDT and BDT+HSO3?；（b）Time dependent fluorescence intensity of BDT-HSO3?.（［BDT］=8×10?6mol·L?1，［HSO3-］=4×10?5mol·L?1）

2.3 響應(yīng)機(jī)理

為了考察響應(yīng)機(jī)理，利用等摩爾連續(xù)變化法測(cè)得BDT與HSO3?以1∶1化學(xué)計(jì)量比相互作用（圖7）。高分辨質(zhì)譜中m/z440.062 62［計(jì)算值，m/z440.070 46］的峰對(duì)應(yīng)于［BDT+HSO3--H］，進(jìn)一步證明BDT與HSO3-形成1∶1的加成產(chǎn)物（圖8）。

圖7 BDT-HSO3? 的結(jié)合比測(cè)定，（［BDT］+［HSO3?］=20 μmol/L）Fig.7 Determination of BDT-HSO3? binding ratio，（［BDT］+［HSO3?］=20 μmol/L）

圖8 在CH3CN中BDT加入HSO3?后的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectrum after adding HSO3?to BDT in CH3CN

以d6-DMSO為溶劑，通過(guò)1H NMR進(jìn)一步研究了BDT與HSO3?的反應(yīng)模式（圖9）。加入 HSO3?后 ，乙 烯 基 質(zhì) 子 Hb（8.19）和 Hc（7.88）的質(zhì)子峰信號(hào)分別向高場(chǎng)方向移動(dòng)至4.98和4.81，此外，噻唑N原子鄰位的亞甲基Ha從6.23移動(dòng)至4.05。這些結(jié)果表明，探針BDT與HSO3?在不飽和C=C雙鍵處進(jìn)行作用，使整個(gè)分子的共軛程度降低，ICT效應(yīng)受阻，參與電子離域的質(zhì)子周圍電荷密度增大，進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)子向高場(chǎng)方向移動(dòng)。因此，我們推測(cè)HSO3?與BDT以1，4-加成的方式發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。

圖9 d6-DMSO中BDT和BDT+HSO3?的1H NMR譜及其傳感機(jī)理Fig.9 1H NMR spectra of BDT and BDT+HSO3?in d6-DMSO and the sensing mechanism

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

HSO3?是一種重要的食品添加劑，已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，但食品中過(guò)量的HSO3?可能會(huì)導(dǎo)致一些健康問(wèn)題。為了評(píng)估探針BDT對(duì)實(shí)際樣品中HSO3?的檢測(cè)能力，將BDT應(yīng)用于白糖和白酒中3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次后取平均值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到該實(shí)驗(yàn)的回收率，結(jié)果如表1所示，白糖和白酒中HSO3?的回收率在90.6%～107.5%之間，精確度良好。說(shuō)明探針BDT在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有可靠的應(yīng)用價(jià)值。

表1 探針BDT對(duì)食品樣品中HSO3?濃度的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of HSO3?in food samples using BDT probe

2.5 細(xì)胞熒光成像

采用MTT法檢測(cè)了探針的細(xì)胞毒性。如圖10所示，HeLa細(xì)胞與不同濃度的BDT溶液（0～30 μmol·L?1）共同孵育 12 h，細(xì)胞存活率大于90%，表明探針BDT具有良好的生物相容性和低細(xì)胞毒性。

圖10 BDT對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of BDT to HeLa cells

為了進(jìn)一步研究探針BDT在生物體內(nèi)的潛在應(yīng)用能力，首先對(duì)HeLa細(xì)胞中的HSO3?進(jìn)行了體外熒光成像實(shí)驗(yàn)。如圖11所示，將探針BDT（10 μmol·L?1）與 HeLa 細(xì) 胞 共 同 孵 育 20 min 后，加入 20 μmol·L?1HSO3?繼續(xù)孵育，隨著孵育時(shí)間的增加，橙色通道中熒光信號(hào)減弱，而藍(lán)色通道中熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，這與該探針在溶液中的光學(xué)行為表現(xiàn)一致。且在此過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)較好，表明探針BDT能夠檢測(cè)活細(xì)胞中的外源性HSO3?。

圖11 探針BDT與HSO3?共同孵育的共聚焦圖像Fig.11 Confocal images of BDT（10 μmol·L?1）treated with HSO3?（20 μmol·L?1）in HeLa cells

隨后，我們對(duì)HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性HSO3?的檢測(cè)進(jìn)行了評(píng)估，使用Cys作為刺激產(chǎn)生SO2的興奮劑，如圖 12 所示，HeLa細(xì)胞與 10 μmol·L?1探針共同孵育時(shí)只能觀察到橙色通道熒光信號(hào)，而加入 250 μmol·L?1Cys后，藍(lán)色通道出現(xiàn)熒光信號(hào)，橙色通道熒光減弱。表明Cys刺激產(chǎn)生的SO2與探針BDT產(chǎn)生作用。以上結(jié)果表明，探針BDT具有良好的細(xì)胞膜通透性，在活細(xì)胞中監(jiān)測(cè)內(nèi)源性以及外源性HSO3?均具有良好的應(yīng)用潛力。

圖12 HeLa細(xì)胞的共聚焦圖像，（a）用10 μmol·L?1BDT孵育；（b）用10 μmol·L?1BDT和250 μmol·L?1Cys共同孵育Fig.12 Confocal images of HeLa cells，（a）incubated with 10 μmol·L?1BDT；（b）incubated with 10 μmol·L?1BDT and 250 μmol·L?1Cys

3 結(jié)論

本文以苯并噻唑?yàn)闊晒鈭F(tuán)，設(shè)計(jì)合成了一種比率檢測(cè)HSO3?的熒光探針BDT。在接近100%的水體系中，探針BDT與HSO3?發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，引起熒光光譜及溶液顏色的顯著變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HSO3?的熒光傳感及裸眼識(shí)別。在實(shí)際應(yīng)用中，探針BDT能夠有效檢測(cè)食品樣品白糖和白酒中HSO3?的含量，并可用于對(duì)活體細(xì)胞中HSO3?的熒光成像。因此，該探針在傳感、生物樣品信號(hào)傳導(dǎo)及檢測(cè)方面均具有良好的應(yīng)用前景。