石福臣，張梅

（南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071）

0 引言

長(zhǎng)芒莧（Amaranthus palmeri）屬莧科（Ama?ranthaceae）、莧屬植物，原產(chǎn)美洲，長(zhǎng)芒莧的一些特性使其成為全球性惡性雜草并難以防除，例如光合C4途徑，其光合速率是大豆和棉花的3～4倍［1-2］；極高的繁殖能力和生長(zhǎng)速率，自然狀態(tài)下每株長(zhǎng)芒莧可產(chǎn)生60萬(wàn)粒種子，株高可達(dá)2 m～3 m；極強(qiáng)的極端環(huán)境的耐受能力和遺傳變異能力［3］。此外，長(zhǎng)芒莧對(duì)多種除草劑產(chǎn)生抗藥性更使其成為世界頭等惡性雜草［4］。

長(zhǎng)芒莧于1985年首次發(fā)現(xiàn)于中國(guó)北京市豐臺(tái)區(qū)，經(jīng)過(guò)近30年的潛伏傳播后，近幾年在京津冀地區(qū)呈現(xiàn)爆發(fā)性入侵與擴(kuò)散趨勢(shì)，迅速入侵至農(nóng)田、果園等經(jīng)濟(jì)作物生長(zhǎng)區(qū)，與經(jīng)濟(jì)作物進(jìn)行養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)，搶奪水分、光照資源，有的甚至比經(jīng)濟(jì)作物（玉米、果樹(shù)）還高，這對(duì)當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和生物多樣性安全造成巨大的威脅和破壞。國(guó)內(nèi)對(duì)于長(zhǎng)芒莧的研究較少，主要包括：李慧琪等預(yù)測(cè)了長(zhǎng)芒莧在中國(guó)的潛在分布區(qū)，長(zhǎng)芒莧在中國(guó)的潛在分布集中在華北平原地區(qū)［5］；曹晶晶等研究表明：表型變異（如高緯度種群開(kāi)花時(shí)間提前）可提高長(zhǎng)芒莧環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化，拓展其在中國(guó)的適生性分布區(qū)，增強(qiáng)其向原產(chǎn)地適應(yīng)環(huán)境梯度之外地區(qū)入侵和擴(kuò)散蔓延的潛力［6］；本研究組前期進(jìn)行了關(guān)于長(zhǎng)芒莧表型可塑性的研究［7］。

外來(lái)植物的入侵機(jī)制十分復(fù)雜，包括增強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)能力、化感作用、根際理化性質(zhì)改變以及微生物區(qū)系的變化等［8-10］。近年來(lái)，從植物-土壤-微生物群落組成研究外來(lái)植物的入侵機(jī)制已成為新的研究思路和重要的發(fā)展趨勢(shì)。紫莖澤蘭入侵會(huì)改變土壤微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)，引起有益功能菌聚集和土壤酶活性的改變，形成有利于紫莖澤蘭入侵?jǐn)U張的微生態(tài)環(huán)境［11］；Smooth brome入侵增加了土壤細(xì)菌的豐富度和均勻度，最重要的作用是選擇性抑制優(yōu)勢(shì)菌種，使較少見(jiàn)的細(xì)菌相對(duì)豐度增加［12］；Robinia pseudoacacia入侵主要改變了土壤細(xì)菌的豐富度，這種改變主要是由放線菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)等細(xì)菌門(mén)類所驅(qū)動(dòng)［13］；薇甘菊（Mikania micrantha）通過(guò)改變土壤微生物群落豐度，從而調(diào)節(jié)土壤碳的循環(huán)利用實(shí)現(xiàn)入侵［14］；加拿大薊（Cirsium arvense）通過(guò)改變土壤微生物降低一些本地植物的性能，但自身的性能并沒(méi)有因此而改變，進(jìn)而使加拿大薊形成競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)［15］。Cheng等對(duì)于入侵植物歐洲千里光（Senecio vulgaris）根際和內(nèi)生細(xì)菌群落的研究發(fā)現(xiàn)了許多和解磷（Brevundimonas diminu?ta）、固氮（Rhizobium leguminosarum）、耐受極端環(huán) 境（Exiguobacterium sibiricum）相 關(guān) 的 細(xì)菌［16］。因此，從土壤微生物角度揭示長(zhǎng)芒莧的入侵機(jī)制，從而抑制其進(jìn)一步的擴(kuò)散和蔓延，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

本研究通過(guò)野外調(diào)查取樣，結(jié)合三代高通量測(cè)序技術(shù)，研究四種典型生境下有無(wú)長(zhǎng)芒莧入侵對(duì)土壤微生物多樣性和種類的影響。旨在探討以下問(wèn)題：（1）不同生境下長(zhǎng)芒莧入侵是否會(huì)影響土壤細(xì)菌群落組成和多樣性；（2）不同生境下是否存在有助于長(zhǎng)芒莧入侵的不同類型的核心微生物。

1 材料與方法

1.1 樣地概況及樣品采集

本研究采樣點(diǎn)位于天津市武清區(qū)（117°16ˊE，39°59ˊN），該地區(qū)屬溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，海拔年均氣溫11.6℃，年降水量606 mm（圖1）。該地區(qū)為長(zhǎng)芒莧重度入侵區(qū)域，并且在多種生境下形成單優(yōu)群落，是進(jìn)行長(zhǎng)芒莧土壤細(xì)菌群落多樣性研究的理想取樣點(diǎn)。其主要伴生草本植物有狗尾草（Setaria Viridis）、藜（Chenopodium album）、虎尾草（Chloris virga?ta）、玉米（Zea mays）等。

圖1 采樣點(diǎn)及生境設(shè)置。A，河岸生境、B，路邊生境、C，荒地生境、D，農(nóng)田生境Fig.1 Location of research site and four types of sampling habitats:riverbank(A),roadside(B),wasteland(C)and farmland(D)habitats

本研究選擇河岸（A）、路旁（B）荒地（C）和農(nóng)田（D）等4種典型生境類型，每種生境設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)間隔30 m～50 m。每個(gè)采樣點(diǎn)分為長(zhǎng)芒莧入侵區(qū)（蓋度大于70%）和非入侵區(qū)，每個(gè)區(qū)域設(shè)置面積為2 m×2 m的樣方，兩個(gè)區(qū)域間隔3 m～5 m。每個(gè)樣方土壤采集采用五點(diǎn)取樣法，去除表面的枯枝落葉后，用土鉆收集0～10 cm處的土壤，混合為一個(gè)樣品。共采集4（生境）×2（土壤類型）×3（重復(fù)）=24份土壤樣品。所有土壤樣品放入液氮罐中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，剔除可見(jiàn)根系和石塊并混勻后過(guò)4 mm篩，在?20℃冰箱中保存暫存，通過(guò)北京百邁客公司高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行微生物測(cè)序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

使用MN NucleoSpin 96 Soil試劑盒對(duì)土壤樣品基因組DNA進(jìn)行提取。選用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì) 細(xì) 菌16S全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）包括：基因組 DNA 40 ng～60 ng，2.5 μL*Vn F（5′端引物）（10 μmol·L-1），2.5 μL*Vn R（3′端引物）（10 μmol·L-1），1 μL KOD FX Neo（TOYO?BO），25 μL KOD FX Neo Buf（2X）。 10 μL 2 mmol?L-1dNTP，補(bǔ) ddH2O 至總體系 50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)包括（95℃，30；50℃，30；72℃，1 min/1 kb）；72℃延伸5 min。PCR結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)磁珠法回收后，純化后的產(chǎn)物進(jìn)行Nanodrop 2000定量后，按照質(zhì)量比1∶1進(jìn)行混樣。由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行后續(xù)的樣品建庫(kù)，上PacBio測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT Cell）的方法對(duì)marker基因進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始下機(jī)subreads進(jìn)行校正得到CCS（Circular Consensus Sequencing）序 列（SMRT Link，version8.0），然后使用 lima（v1.7.0）軟件，通過(guò)barcode序列識(shí)別不同樣品的CCS序列并去除嵌合體（version 8.1），得到高質(zhì)量的CCS序列。在相似性97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類，以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾 OTU（Operational Taxonomic Unit）。通過(guò)Venn圖呈現(xiàn)各樣本所共有和獨(dú)有OTU所占的比例，應(yīng)用Mothur versionv.1.30軟件對(duì)Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，計(jì)算ACE、Chao1、Shan?non和Simpson等物種多樣性指數(shù)。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析，評(píng)價(jià)入侵、生境及其交互作用對(duì)細(xì)菌群落alpha多樣性指數(shù)的影響。為了將不同生境的聚類可視化，基于binary-jaccard構(gòu)建非度量多維尺度圖（NMDS）。此外，利用線性判別分析（LDA）和LEfSe方法探究不同生境下的生物標(biāo)志物。運(yùn)用R軟件進(jìn)行各種分析圖的繪制與結(jié)果輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

24個(gè)樣品測(cè)序后通過(guò)Barcode識(shí)別后共獲得180 441條CCS序列，平均產(chǎn)生7 518條CCS序列。利用Mothur軟件進(jìn)行rarefaction分析，繪制稀疏性曲線（圖2）。隨著序列數(shù)目增加，各處理的稀疏性曲線趨于平緩。說(shuō)明擴(kuò)增序列可以真實(shí)反映各個(gè)土壤樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，測(cè)序深度足夠。

2.2 異質(zhì)生境下入侵區(qū)和未入侵區(qū)OTU分析

Venn圖可以直觀的體現(xiàn)土壤細(xì)菌群落OTU組成的差異性及重疊情況（圖3）。在河岸（A）、路邊（B）、荒地（C）和農(nóng)田（D）4種生境中，入侵樣地分別檢測(cè)到1 814、1 647、1 593和1 608個(gè)細(xì)菌OTUs，未入侵樣地分別檢測(cè)到2 105、1 615、1 909和1 448個(gè)細(xì)菌OTUs。其中入侵樣地，A、B、C、D四種生境各自獨(dú)有314、145、117和240個(gè)OTUs，而在非入侵樣地分別獨(dú)有 213（A）、201（B）、127（C）和 104（D）個(gè)OTUs（圖 2）。

圖3 四種生境有無(wú)長(zhǎng)芒莧入侵的Veen圖。A、B、C、D分別表示河岸、路邊、荒地和農(nóng)田生境Fig.3 Venn diagrams of shared OTUs(number of OTUs)of invaded(left)and non-invaded(right)byA.palmeri plants under four sampling habitats.Letters in the figure,A:riverbank,B:roadside C:wasteland D:farmland

2.3 土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

用Chao1和ACE指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。由表1可知，河岸生境和荒地生境土壤細(xì)菌的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)較高，ACE指數(shù)在生境C和D間存在顯著差異（P<0.05）。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。由表1可知，荒地生境土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)值最高，且顯著高于河岸生境（P<0.05），河岸生境土壤細(xì)菌的Simpson指數(shù)最高，且顯著高于生境荒地和農(nóng)田生境（P<0.05）。這表明土壤細(xì)菌群落的物種豐富度和多樣性因環(huán)境的不同而存在較大差異。

表1 異質(zhì)生境下入侵和非入侵樣地細(xì)菌群落的Alpha多樣性Table 1 Alpha diversity of bacterial community in the invasive and non-invasive plots under four habitats

長(zhǎng)芒莧入侵區(qū)和未入侵區(qū)土壤細(xì)菌的Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)均不存在顯著差異（P>0.05）。雙因素方差分析表明：除生境對(duì)Simpson指數(shù)具有顯著影響（P<0.05）外，入侵、生境及二者的相互作用均未對(duì)Alpha多樣性產(chǎn)生顯著影響（P>0.05），表明長(zhǎng)芒莧入侵對(duì)土壤細(xì)菌群落的物種豐富度和多樣性未造成較大的影響。

2.4 土壤細(xì)菌群落在門(mén)水平上的組成差異

細(xì)菌門(mén)分類水平的組成表明，4種生境中的主要優(yōu)勢(shì)門(mén)類為變形菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)和酸桿菌門(mén)（圖4）。變形菌門(mén)是豐度最高的類群，A、B、C、D四種生境下未入侵區(qū)的相對(duì)豐度為37.91%、29.71%、27.15%和27.42%，入侵區(qū)的相對(duì)豐度為42.75%、26.08%、30.35%和28.41%。浮霉菌門(mén)是第大二優(yōu)勢(shì)門(mén)類，非入侵樣地的相對(duì)豐度分別為7.61%（A）、13.41%（B）、19.24%（C）、20.57%（D），入侵樣地的相對(duì)豐度分別為5.38%（A）、21.79%（B）、19.78%（C）、21.34%（D）。

圖4 4種生境下長(zhǎng)芒莧入侵區(qū)和未入侵區(qū)土壤細(xì)菌群落在門(mén)水平的分類組成。圖例顯示了按物種數(shù)量分類的前10個(gè)物種。其他的分類為“Others”，未注釋的物種分類“Unclassified”。A、B、C、D分別表示河岸、路邊、荒地和農(nóng)田生境Fig.4 Phylum-level taxonomic composition of the bacterial community in the soil ofA.palmeri invaded and non-invaded plots under four habitats.The legend at the top right shows the top 10 species classified by species abundance.The others are classified as "Others",and the unannotated species are classified as "Unclassified"

與非入侵區(qū)相比，河岸和荒地生境下長(zhǎng)芒莧土壤中變形菌門(mén)的相對(duì)豐度分別增加了12.77%和11.79%，路邊生境下浮霉菌門(mén)的豐度增加了62.49%，而河岸生境下浮霉菌門(mén)的豐度減少了41.45%。更重要的是，與非入侵區(qū)相比，長(zhǎng)芒莧入侵區(qū)土壤細(xì)菌的第三大細(xì)菌門(mén)由芽單胞菌門(mén)轉(zhuǎn)變?yōu)閿M桿菌門(mén)。這些變化主要與河岸、荒地和農(nóng)田三種生境中擬桿菌門(mén)豐度的明顯增加以及芽單胞菌門(mén)的豐度明顯降低有關(guān)。

2.5 長(zhǎng)芒莧入侵四種生境下指示微生物的篩選

采用LEfSe（線性判別分析效應(yīng)量）分析方法，鑒定4種生境中有顯著差異的細(xì)菌類群（LDA>4.0）。從內(nèi)到外的分類圖代表了從門(mén)到種的分類水平（圖5）。與非入侵區(qū)相比，河岸生境下長(zhǎng)芒莧土壤細(xì)菌中的差異微生物為β-變形菌目、伯克氏菌科、Saccharimonadaceae科、黃單胞 菌 科、Flavisolibacter屬、Candida?tus_Saccharimonas種和Flavisolibacter_sp種；荒地生境下長(zhǎng)芒莧入侵區(qū)的核心類群為芽單胞菌綱和芽單胞菌科；同時(shí)，亞硝化單胞菌科和Phycisphaeraceae科在農(nóng)田入侵生境中的相對(duì)豐度較高；路邊生境下僅Sphingomonas_sediminic?ola種被鑒定為關(guān)鍵的土壤微生物類群（表2）。

圖5 采用線性判別分析（LDA）對(duì)不同生境下長(zhǎng)芒莧入侵區(qū)（上）和無(wú)入侵區(qū)（下）的LEfSe分析。不同生境中不同類群的微生物豐度差異顯著，用彩色圓點(diǎn)表示，圓圈表示從門(mén)到種的系統(tǒng)發(fā)育水平。A、B、C、D分別表示河岸、路邊、荒地和農(nóng)田生境Fig.5 Cladograms via linear discriminate analysis(LDA)of effect size(LEfSe)with an LDAscore higher than 4.0 ofA.palmeri invasive(top)and non-invasive(bottom)treatments under heterogeneous habitats.Significant differences in microbial abundances according to taxa among habitats are represented by colored dots.Circles represent phylogenetic levels from kingdom to genus

表2 異質(zhì)生境下入侵和非入侵樣地Biomarker差異分析Table 2 Variation analysis of Biomarker in the invasive and non-invasive plots under four habitats

3 討論

大量研究證實(shí)土壤微生物群落在外來(lái)植物入侵過(guò)程中扮演了十分重要的角色［13，17-18］，研究長(zhǎng)芒莧入侵對(duì)土壤微生物多樣性的影響是揭示其入侵機(jī)制的重要途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)芒莧入侵區(qū)土壤細(xì)菌OTU數(shù)量、微生物多樣性指標(biāo)（Chao1、ACE、Shan?non、Simpson）均略低于未入侵區(qū)，但均未呈現(xiàn)顯著差異（P>0.05）（表1）。這與大多數(shù)的研究不同，但該結(jié)果與Kamutando等對(duì)于Acacia dealbata的研究有相似的結(jié)論，并且Kamutando認(rèn)為微生物群落分析方法不能準(zhǔn)確地估計(jì)微生物的豐富度，在微生物群落生態(tài)學(xué)和生物多樣性研究中應(yīng)慎重地應(yīng)用多樣性指數(shù)［19-20］，因此，多種方法的結(jié)合可能會(huì)使信息獲得存在一個(gè)最佳的平衡點(diǎn)［19，21］。

在細(xì)菌門(mén)分類水平上，變形菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)是相對(duì)豐度較高的門(mén)類，這些菌群在其他植物入侵區(qū)也有大量報(bào)道，包括日本藍(lán)莓［22］，Acacia dealbata［20］和Cir?sium arvense［23］等。變形菌門(mén)是豐度最高的優(yōu)勢(shì)類群，我們的研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了變形菌門(mén)是陸地土壤生態(tài)系統(tǒng)細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌群［24］。與非入侵樣地相比，長(zhǎng)芒莧入侵河岸生境通過(guò)聚集生長(zhǎng)速度較快的細(xì)菌門(mén)類，如變形菌門(mén)，減少生長(zhǎng)速度較慢細(xì)菌門(mén)類的累積（如酸桿菌門(mén)和浮霉菌門(mén)），形成對(duì)自身有利的生長(zhǎng)環(huán)境，以在該生境中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位［24-26］。浮霉菌門(mén)可能在長(zhǎng)芒莧入侵路邊生境中具有重要意義，其在該生境具有極高的富集比例，這可能是因?yàn)楦∶咕T(mén)在生態(tài)系統(tǒng)氮和碳循環(huán)中發(fā)揮重要作用［14，27］。

LEfSe分析表明，長(zhǎng)芒莧入侵河岸生境下的土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群為伯克氏菌科和β-變形菌目。芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）和芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）在長(zhǎng)芒莧入侵荒地生境過(guò)程中發(fā)揮重要作用，長(zhǎng)芒莧入侵路邊生境和農(nóng)田生境的核心細(xì)菌類群分別為Sphin?gomonas_sediminicola和亞硝化單胞菌科。β-變形菌目、伯克氏菌科和亞硝化單胞菌科均隸屬于變形菌門(mén)，前人研究表明這些微生物類群在生態(tài)系統(tǒng)化學(xué)循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著積極的生態(tài)作用［28-30］。例如菌類在固氮，氨氧化以及保護(hù)植物免受土壤病原體侵害等作用［31-32］。Sphin?gomonas_sediminicola于2013年首次從淡水沉積物中分離出來(lái)［33］，Sphingomonasspp.已顯示出促進(jìn)植物生長(zhǎng)的積極作用［34］。長(zhǎng)芒莧入侵土壤中鞘氨醇單胞菌的顯著增加，一方面加速土壤碳氮循環(huán)，另一方面減輕農(nóng)藥、除草劑等污染物對(duì)自身的毒害作用，形成對(duì)自身有利的環(huán)境，加速其入侵［35］。值得注意的是，盡管與非入侵樣地相比，長(zhǎng)芒莧入侵的荒地土壤中芽單胞菌門(mén)的豐度呈下降趨勢(shì)，但芽單胞菌綱和芽單胞菌科仍是該生境的優(yōu)勢(shì)類群。表明這些微生物在長(zhǎng)芒莧入侵荒地過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

4 結(jié)論

本文探討了在異質(zhì)性生境下，長(zhǎng)芒莧入侵對(duì)土壤細(xì)菌群落組成及多樣性的影響。結(jié)果表明：長(zhǎng)芒莧入侵雖然對(duì)土壤細(xì)菌α多樣性未產(chǎn)生較大的影響，但對(duì)細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)影響較大。本研究在不同生境條件下篩選出了一種到幾種可作為長(zhǎng)芒莧土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的指示種。未來(lái)研究可以結(jié)合土壤酶、分泌物、功能基因等方面分析，進(jìn)一步探究導(dǎo)致微生物群落改變的內(nèi)在機(jī)制。