朱大冕，劉文果，沈 靜，余鋒平，孔玨穎，馮 鑫，胡 彥

耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是指體外藥敏試驗證實對利福平和異煙肼同時耐藥的結(jié)核病。根據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織報告，2019年全球約有39萬例MDR-TB患者，我國約有5.46萬例[1]。異煙肼(isoniazid,INH)是結(jié)核病標準化療方案的核心藥物[2]。結(jié)核分枝桿菌(MTB)對INH耐藥后，多采用丙硫異煙胺(protionamide,Pto)代替INH進行治療。乙硫異煙胺(ethionamaide,Eto)/Pto用于MDR-TB治療，是目前WHO推薦的MDR-TB治療藥物之一[3]。異煙肼和Eto/Pto的作用機制是抑制MTB分枝酸的合成[2]，兩藥存在部分交叉耐藥機制[4]，inhA基因及其調(diào)控區(qū)域突變就是其主要分子機制之一[5]。

本研究將探討MTB對INH與Pto的耐藥情況，采用序列分析的方法檢測INH耐藥相關(guān)基因，分析INH與Pto交叉耐藥相關(guān)基因inhA突變特點，為耐藥基因型檢測奠定基礎(chǔ)，也為臨床治療MDR-TB提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選用2014年9月至2019年3月期間來源于重慶39個區(qū)縣的233株INH耐藥MTB臨床分離株以及5株全敏感MTB；中國疾病預防控中心結(jié)核病預防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室提供標準株H37Rv。

1.2 試劑 分離培養(yǎng)、菌種鑒定、藥敏試驗所用試劑均購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)基內(nèi)藥物終濃度分別為：INH 0.2 μg/mL，RFP 40 μg/mL，SM 4 μg/mL，EMB 2 μg/mL，Ofx 4 μg/mL，Km 30 μg/mL，Cm 40 μg/mL，Pto 40 μg/mL，PAS 1 μg/mL，AK 30 μg/mL。

1.3 藥敏試驗及鑒定 藥敏試驗采用比例法，將稀釋好的菌懸液分別接種于對照、含藥及PNB和TCH培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3～4周。根據(jù)耐藥百分比判讀：耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基生長的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基生長的菌落數(shù))×100%。若耐藥百分比大于1%，則認為受試菌對該抗結(jié)核藥耐藥。

1.4 DNA提取 取適量新鮮菌苔于0.5 mL去離子水，85 ℃金屬浴30 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清；0.5 mL TE緩沖液，100 ℃金屬浴20 min；12 000 r/min離心5 min，取上清即為DNA模板。

1.5 基因擴增 耐藥相關(guān)基因測序使用引物見表1。引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體積為50 μL，其中DNA 4 μL，Master MIX 25 μL，引物各2 μL，其余由17 μL滅菌蒸餾水補足。擴增條件為：98 ℃預變性2 min；98 ℃ 30 s，退火 30 s(溫度根據(jù)引物各不同)(表1)，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表1 耐藥相關(guān)基因測序使用引物Tab.1 Primers used for sequencing drug resistance associated genes

1.6 測序及結(jié)果分析 采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，送北京擎科生物技術(shù)有限公司雙向測序。測序結(jié)果與NCBI上的katG、inhA、ahpC、kasA基因標準序列進行比對，運用MEGA 6.0進行突變分析。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏結(jié)果 共收集到233株IHN耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，其中37株與Pto交叉耐藥，交叉耐藥率(15.8%)。233株菌株中MDR-MTB有194株(83.2%)， 前廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌(pre-XDR-MTB:在對INH和RFP耐藥的基礎(chǔ)上,同時對二線注射類藥物或氟喹諾酮類藥物中的一種藥物耐藥)有82株(35.2%)，廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌(XDR-MTB)有8株(3.4%)。菌株來源患者中，男性173例(74.2%)、女性60例(25.8%)，患者平均年齡為46.3歲。詳見表2。

表2 各因素對結(jié)核分枝桿菌INH和 Pto耐藥的影響Tab.2 Effects of various factors on the resistance of MTB to INH and Pto

2.2 耐藥基因測序結(jié)果katG突變情況：標準株及5株全敏感菌株均未檢測到katG突變。233株耐異煙肼菌株中亦未有katG完全缺失。223株 (96.5%)耐藥株katG存在點突變、插入，其中 2個突變位點未見報道(D448G，D419H)。其中195株 (83.6%) 315位點突變 (S315T 188株，S315N 4株，S315I 1株，S315R 2株)；189株 (81.1%)463位點突變(R463L)，166株 (71.2%)與315位點聯(lián)合突變。其他位點突變4株，包括D448G 1株、D419H 1株、2株同義突變。另1株在位點1180/1181插入CG。

inhA突變結(jié)果：標準株及5株全敏感菌株均未檢測到inhA突變。233株INH耐藥株中11株(4.7%)inhA發(fā)生點突變，包括S94A 1株、I194T 1株、C-15T 9株(有4株與katGS315T聯(lián)合突變)。另有3株發(fā)生同義突變。37株P(guān)to耐藥的菌株中，8株發(fā)生點突變且均為C-15T，其中4株katGS315T和inhAC-15T雙基因聯(lián)合突變，余4株均為inhA單基因點突變C-15T。

aphC突變結(jié)果：標準株及5株全敏感MTB未發(fā)現(xiàn)aphC基因突變，233株異煙肼耐藥菌中有1株菌株Leu106Val突變。

kasA突變結(jié)果：標準株及5株全敏感MTB未發(fā)現(xiàn)kasA基因突變，233株異煙肼耐藥菌未有kasA基因突變。詳見表3。

表3 233株異煙肼耐藥菌株基因突變類型及位點情況Tab.3 Gene mutation types and sites in 233 isoniazid resistant strains

3 討 論

異煙肼是結(jié)核病治療的核心藥物, 通過結(jié)核分枝桿菌過氧化氫酶過氧化物酶(katG編碼)活化為殺菌形式。若katG發(fā)生突變，異煙肼活化效率降低或不能活化，導致結(jié)核分枝桿菌對異煙肼發(fā)生不同程度的耐藥[6-7]。其他異煙肼耐藥相關(guān)基因突變也參與異煙肼耐藥，如inhA、ahpC、kasA等。其中，inhA是活化的異煙肼作用靶,inhA與kasA編碼的蛋白合成酶參與分枝菌酸的生物合成，ahpC參與氧化-應(yīng)激應(yīng)答 (oxidativestress)[8]。

本項研究中，233株耐異煙肼菌株katG和inhA突變率分別為96.5%(223/233)、4.72%(11/233)，二者的總突變率為98.7%(230/233)。katG第315位點突變是katG最常見的突變類型，本項研究katG315位點突變率為83.6%(195/233)，與尼泊爾(81.4%)[9]及福建(86.7%)[10]相似，高于華東地區(qū) (64.4%)[11]的報道，提示此位點突變發(fā)生率存在著區(qū)域性差異。據(jù)報道，katG315位點突變可能是由于katG氧化酶活性喪失且保留其過氧化氫酶活性，而這種基因的修飾具有生存優(yōu)勢，很容易在人群中傳播，這也是其成為主要突變類型的原因之一[12-13]。本研究中katG315位點突變類型以S315T 188株最常見，其次為S315N 4株(2.1%)，另S315R有2株、S315I僅1株。而katG463位點突變率(81.1%)雖較高，但據(jù)文獻報道這主要是由于其所在的區(qū)域相對不穩(wěn)定、極易發(fā)生改變所致，此位點的突變與INH耐藥無關(guān)[14]。INH耐藥菌株中inhA發(fā)生點突變率為4.72%(11/233)，包括9株inhA啟動子突變、2株inhA基因突變。inhA啟動子突變以C-15T最為常見。國內(nèi)外報道耐異煙肼菌株中，inhA基因突變所占比例從12%～60%不等[15-18]，可見inhA基因突變存在著明顯的地區(qū)性差異。

文獻報道inhA基因突變常伴有katG突變，二者對INH有協(xié)同耐藥作用[19]，本研究中11株inhA基因突變中4株伴katGS315T突變，也證實這點。Seifert等[20]對2000-2013年的來自49個國家的118篇關(guān)于INH耐藥基因突變的研究進行了系統(tǒng)綜述，發(fā)現(xiàn)全球INH耐藥菌株64%與katG基因315相關(guān)，19%由inhA基因-15位點突變所致。由于大多數(shù)MTB耐藥發(fā)生于katG基因315和inhA基因-15位點，這兩個位點已成為INH耐藥基因檢測的主要位點。本項研究中，katG315位點突變率83.6%，inhA-15位點的突變率4.72%，二者聯(lián)合突變4株，檢測此兩個基因位點可檢測出耐藥基因突變率為85.8%(200/233)，證實通過這兩個位點的耐藥基因型檢測是可行的。

1株ahpC突變菌株對異煙肼耐藥，可能是ahpC突變增強了AhpC的表達，降低過氧化物的濃度，進而抑阻了katG介導的異煙肼活化。233株異煙肼耐藥菌未發(fā)現(xiàn)有kasA基因突變，與陳曦[6]、Mdluli[21]等國內(nèi)外學者的研究結(jié)果不同，估計與擴增區(qū)域不同以及突變地區(qū)間差異有關(guān),同時最近有報道kasA酶對INH耐藥影響尚有爭議[22-23]，kasA基因突變與INH耐藥的關(guān)系還需進一步研究。

Pto屬碳硫胺類似藥，作用機制與INH相似，需被MTB細胞質(zhì)氧化還原酶作用成為細胞毒性成分，進而使MTB細胞膜不能合成霉菌酸及失去酸性，以此發(fā)揮抗結(jié)核功效[24]。兩種藥有共同的作用靶點：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)，NADH依賴的烯酰-ACP還原酶(InhA,Rv1484)[25]。因此，inhA基因、inhA調(diào)控區(qū)域的突變，可致使inhA靶標過度表達或者修飾﹐降低與NAD之間親和力而產(chǎn)生INH與Pto交叉耐藥[23,26-27]。

本研究中，37株INH與Pto共同耐藥菌株中，inhA發(fā)生點突變率為21.6%(8/37)，8例均為inhA基因-15位點突變；雖有4例與katG基因聯(lián)合突變，但Morlock等[26]研究表明未發(fā)現(xiàn)katG基因突變與Pto耐藥相關(guān)。進一步證實Pto耐藥與inhA基因-15位點突變密切相關(guān)，INH與Pto之間存在一定的交叉耐藥率，且交叉耐藥菌株中inhA基因-15位點突變最常見。雖有1例inhA啟動子區(qū)域C-15T位點突變存在于INH耐藥Pto敏感菌株，但可能與其他調(diào)節(jié)因子的代償突變有關(guān)[28]。如研究所示，inhA基因-15位點突變在INH耐藥株中所占比例較小,且傳統(tǒng)藥敏試驗結(jié)果顯示，INH與Pto的交叉耐藥也只有15.8%。因此，INH耐藥特別是無inhA突變的患者可選擇Pto替代INH進行治療。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)異煙肼耐藥菌株基因突變率較高，大多數(shù)發(fā)生于katG基因315位點和inhA基因-15位點，通過檢測這兩個基因位點的分子耐藥診斷學方法可以在重慶地區(qū)得到很好的應(yīng)用，指導臨床用藥。同時INH與Pto存在著一定的交叉耐藥，但耐藥率較低，為INH耐藥及耐多藥結(jié)核病化療方案中Pto的合理選擇提供參考；Pto耐藥的發(fā)生與inhA基因-15位點突變密切相關(guān)，這為inhA基因突變應(yīng)用于INH與Pto交叉耐藥快速診斷奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無

引用本文格式：朱大冕，劉文果，沈靜，等. 重慶地區(qū)結(jié)核分枝桿菌異煙肼和丙硫異煙胺耐藥及其交叉耐藥相關(guān)基因突變研究[J].中國人獸共患病學報，2022，38(5)：405-409. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.047