朱麗蒙，韓雪瑩，馬 楠，任曉妮，王小樂，張 暋

(鄭州金域臨床檢驗中心/鄭州市分子醫(yī)學診斷工程技術研究中心，河南 鄭州 450016)

根據2020年腫瘤年報，肺癌是河南省發(fā)病率和死亡率排第一的惡性腫瘤，中晚期肺癌的5年生存率僅為15%，給肺癌患者造成嚴重的生命威脅和巨大的經濟損失[1]。酪氨酸激酶抑制劑(TKI)可特異性結合表皮生長因子受體(EGFR)基因敏感突變位點，抑制腫瘤生長，改善晚期肺癌患者的生存和預后。美國國立綜合癌癥網(NCCN)2021年V1版《非小細胞肺癌診治指南》中提出，所有局部晚期或轉移性非小細胞肺癌(NSCLC)患者均應檢測EGFR，EGFR基因敏感突變位點陽性患者才有可能從EGFR-TKI的靶向治療中獲益[2]。

EGFR基因突變主要分布在酪氨酸激酶區(qū)域的18～21號外顯子上，已有報道的常見突變和罕見突變包括30余種，不同突變分型的靶向治療效果和突變率不同[3]。例如，EGFR基因19號外顯子缺失(19DEL)，約占肺癌EGFR突變的45%，預示患者對EGFR-TKI用藥敏感；21號外顯子L858R 突變也是主要的敏感突變類型，約占EGFR突變的40%；20號外顯子T790M突變，是第790位密碼子的蘇氨酸(T) 被蛋氨酸(M) 替代，導致 EGFR TK區(qū)域與靶向TKI藥物的親和力降低，從而產生耐藥，在獲得性耐藥患者中，突變率約占50%。因此，分析肺癌患者EGFR突變譜具有重要的臨床意義。研究表明，肺癌患者中，EGFR突變率與臨床特征和病理分型有關，女性、肺腺癌、多發(fā)轉移患者，EGFR基因突變率更高；而年齡、腫瘤病理分級和臨床分期則與EGFR基因總突變率有顯著相關性[4]。另外，不同地區(qū)由于遺傳、環(huán)境和生活習慣不同，患者的EGFR突變率可能會受到影響[5-6]。但不同地區(qū)和人群的EGFR基因突變譜的臨床特征目前研究尚不完善，傳統(tǒng)檢測技術對復合突變的檢出率低，需要高通量的檢測技術進行數據積累、研究和補充。臨床靶向治療中，攜帶不同EGFR分子分型的肺癌患者，對臨床靶向治療的影響不同，因此，急需EGFR基因分子分型的相關臨床研究，為肺癌分子診斷和靶向治療方案制定提供參考依據。

本文擬采用二代測序技術，檢測來自河南地區(qū)肺癌樣本中的EGFR基因突變，分析EGFR基因突變分型在肺癌中的典型特征，從而闡述EGFR基因突變譜和分子分型的臨床特征和意義，探討EGFR基因突變分型在肺癌輔助診斷和病理分型中的可能性，為肺癌的臨床診斷和靶向治療提供精準的基因參考信息。

1 資料與方法

1.1臨床資料 對2019年7月至2021年2月采集的895例肺癌患者樣本進行回顧性分析。患者均確診為肺癌，登記患者性別、年齡、病理分型、臨床癥狀、是否轉移等基本資料。樣本和患者資料來自河南省41個縣市的134家醫(yī)院，通過第三方醫(yī)檢公司鄭州金域臨床檢驗中心匯總檢測。本研究通過金域醫(yī)學倫理委員會審核，研究程序符合倫理要求。

1.2試劑與方法 福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本，經病理蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察視野內腫瘤細胞數占20%以上，并劃分刮取腫瘤細胞范圍，提取腫瘤DNA樣本。使用凱杰試劑盒(貨號：56404)采集血漿，血漿樣本體積要求2～4 mL。使用凱杰試劑盒(貨號：55184)提取血漿循環(huán)游離DNA(cfDNA)樣本。采用二代測序方法檢測已提取DNA中的EGFR全外顯子和部分內含子區(qū)域的點突變和小片段插入/缺失、剪切子變異、拷貝數變異突變。其中使用到KAPPA構庫試劑、IDT定制靶向探針、Illumina上機試劑(貨號：FC-404-2004)。結果經生物信息分析，采用bwa(0.7.10-r789)+Picard(v 1.128)+Genome Analysis Toolkit(GATK v3.5)等工具將測序原始數據轉變成易存儲、易理解的變體調用格式(vcf)，得出突變結果注釋表。依據美國《醫(yī)學遺傳學與基因組學學會解讀標準和分子病理報告指南》，參考腫瘤數據庫和人群數據庫，對結果注釋表進行人工分析和突變結果分類篩選。數據質控指標：Q30>0.85，捕獲特異性大于65%，靶向區(qū)域覆蓋度大于99%，去重后深度大于500X的靶向區(qū)域大于90%。要求檢測突變靈敏度達到0.5%。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計數資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗、連續(xù)校正χ2檢驗和Fisher確切概率法分析檢出率之間的統(tǒng)計學差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1樣本特征 895例肺癌患者中年齡23～91歲，年齡中位數67歲，不同年齡段數量分布見圖1。肺癌患者中肺腺癌315例，肺鱗癌40例；多發(fā)轉移性28例，肺占位42例，胸腔積液10例。按樣本類型分，共收集FFPE組織樣本779例，血漿樣本116例。

圖1 895例肺癌患者年齡特征

2.2.1不同臨床診斷組EGFR分型突變率比較 不同臨床診斷組的EGFR基因分子分型突變率與肺癌總突變率進行縱向結果對比統(tǒng)計見表1。組1中EGFR總突變率和各突變分型突變率與肺癌總體比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。組2中EGFR基因總突變率，T790M、20INS 2個分型的突變率與肺癌總體比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但L858R、19DEL、EGFR擴增3個分型的突變率與肺癌總體比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組3中EGFR總突變率和L858R、T790M 2個分型的突變率與肺癌總體比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，19DEL、20INS、EGFR擴增3個分型的突變率與肺癌總體比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。組4中EGFR基因總突變率和各基因突變型的陽性率與肺癌總體比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 不同臨床診斷組EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.2.2不同病理分型組EGFR分型突變率比較 肺腺癌組EGFR總突變率和L858R、19DEL 2種分型的突變率與肺鱗癌組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且肺腺癌突變率高于肺鱗癌組；T790M突變在肺鱗癌組中無陽性樣本。肺腺癌組20INS、EGFR擴增分型突變率與肺鱗癌組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。無統(tǒng)計學差異的2種突變分型均為EGFR-TKI耐藥機制。見表2。

表2 不同病理分型組EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.2.3不同性別組EGFR分型突變率比較 不同性別組間EGFR基因總突變率，L858R、19DEL、20INS、T790M 4種分型突變率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，女性突變率均高于男性。不同性別組間EGFR擴增突變率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同性別組EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.2.4不同標本類型組EGFR分型突變率比較 血漿cfDNA組EGFR基因總突變率和各分子分型突變率與組織FFPE組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 組織FFPE組的總陽性、L858R、19DEL、擴增4種分型突變率略高于血漿cfDNA組，而20INS、T790M 2種分型突變率略低于血漿cfDNA組。見表4。20INS、T790M均為EGFR-TKI耐藥突變。拷貝數擴增的檢測，需要樣本中具有較為完整的DNA片段。分析突變頻率不同的原因可能跟標本臨床治療階段和標本DNA的完整度有關。

表4 不同標本類型的EGFR分型突變率比較[ n(%)]

2.3肺癌不同臨床組的EGFR基因突變數目分類特征 (1)按單突變和復合突變，肺腺癌和肺鱗癌的突變分型計數見表5。(2)按單突變和復合突變，有明確臨床診斷特征的EGFR突變陽性肺癌患者的突變類型統(tǒng)計數目見表6。

表5 肺腺癌和肺鱗癌突變分型計數表

續(xù)表5 肺腺癌和肺鱗癌突變分型計數表

表6 肺癌臨床組EGFR基因突變數目分類計數表

3 討 論

EGFR是肺癌中首個具有臨床意義的驅動基因，攜帶EGFR特定突變的肺癌患者，可能從靶向治療中獲益，從而延長該類患者的無進展生存期。本研究結果，河南地區(qū)895例肺癌患者EGFR突變率為53.97%，國內已有報道的各地區(qū)肺癌患者EGFR基因突變率為20%～60%，主要影響因素可能有檢測技術、研究人群、地區(qū)和遺傳等[5-8]。本研究結果表明，在EGFR的總突變率方面，女性肺癌患者高于男性，肺腺癌高于肺鱗癌，中高分化肺癌高于低分化肺癌，與已有研究結果一致[7-9]。同時，本研究發(fā)現，EGFR擴增在性別之間及肺腺癌和肺鱗癌之間均無統(tǒng)計學差異，提示EGFR基因突變率較低的男性或肺鱗癌患者，可關注EGFR擴增，尋找新的診斷治療方案。另外，本研究還發(fā)現EGFR分子分型在不同的患者和標本類型中有不同的分布特征。

3.1不同臨床診斷組EGFR分子分型特征 EGFR分子分型在不同的臨床診斷組中有不同的分布特征。HAYASHI等[10]研究表明，轉移性、侵襲性腫瘤中EGFR突變率較高，并可能常與EGFR基因復合突變同時出現，本研究肺癌多發(fā)轉移組中，EGFR基因突變率比肺癌總體和其他臨床組更高，同時，單突變和復合突變發(fā)生數目最多的均為轉移性腫瘤組，與HAYASHI等[10]研究一致。本研究肺癌轉移患者的EGFR基因突變分型特征，表現在L858R、19DEL、EGFR擴增3個分型的突變頻率比肺癌總體突變頻率高，L858R、19DEL為EGFR-TKI敏感突變，EGFR擴增可能導致EGFR蛋白過表達，文獻報道其可能是EGFR-TKI治療的不利因素，需要在治療中增加EGFR單抗類藥物[11-12]。提示檢測EGFR基因突變的同時，檢測EGFR擴增，可幫助肺癌轉移患者靶向治療制定全面的治療方案。

肺癌胸腔積液在晚期NSCLC患者的初診發(fā)生率為10%～15%，晚期NSCLC患者的胸腔積液與EGFR基因突變率有相關性[13]。本研究胸腔積液組EGFR基因突變率較高，與肺癌總體相比，有統(tǒng)計學差異的突變?yōu)長858R和T790M。T790M突變?yōu)橐淮投鶨GFR-TKI耐藥突變，三代EGFR-TKI敏感突變多為繼發(fā)突變，是常見的肺癌耐藥因素，也是更改靶向治療方案的主導因素。

3.2不同病理類型組EGFR分子分型特征 肺鱗癌和肺腺癌之間，EGFR基因突變分型特征主要體現在EGFR基因L858R和19DEL在肺腺癌中突變率較高，而EGFR基因擴增突變率在肺鱗癌中與肺腺癌中無統(tǒng)計學差異。PI等[14]研究了晚期肺腺癌中EGFR基因突變，所有突變類型中EGFR 19DEL基因突變率占50.7%，21號外顯子L858R基因突變率占43.4%，本研究結果與之接近。肺鱗癌中EGFR拷貝數擴增的突變率較高，其機制尚不明確。臨床數據表明，EGFR擴增的NSCLC患者生存時間較無EGFR擴增的患者短，但其與患者預后的相關性有待進一步研究[7]。另外，有文獻報道，在早期肺癌、腺癌及非吸煙的女性患者中，EGFR 基因外顯子突變常同時伴有EGFR基因的擴增[15]，本研究中，EGFR突變伴隨擴增，主要發(fā)生在肺腺癌中，占復合突變總數的40.62%(13/32)，可能與肺癌進展有關，而肺鱗癌中EGFR擴增以單突變?yōu)橹鳌?/p>

3.3不同性別組EGFR分子分型特征 對比不同性別組間突變分型陽性率，L858R/19DEL/20INS均有顯著差異，且女性較高，而T790M/擴增無統(tǒng)計學差異，EGFR基因擴增在男性中的數量高于女性?？芍?，男性和女性有不同的EGFR基因突變分型特征，EGFR突變陰性的男性肺癌患者可關注EGFR基因擴增的檢測，擴大靶向治療指導用藥范圍。

3.4不同標本類型組EGFR分子分型特征 液體活檢主要針對cfDNA和循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)。其中cfDNA是肺癌中研究最多、被廣泛采用的腫瘤基因分型來源，已經進入了檢測敏感和耐藥EGFR突變的臨床實踐。近幾年，通過下一代測序進行更全面的血漿基因分型已被應用于臨床，并從晚期/轉移性疾病轉移到新的前沿，如早期檢測和微小殘留病灶評估[16]。一項AURA試驗的回顧性分析結果表明，液體活檢的EGFR基因突變與組織活檢的陽性一致性為61%[17]，但本研究血漿標本和組織標本總突變率和各突變分型之間無統(tǒng)計學差異。分析原因可能是臨床有選擇性送檢，血漿樣本主要來源為轉移性肺癌和耐藥后基因監(jiān)測，因而EGFR突變率升高，另外，高通量測序技術(NGS)的使用提高了檢測的靈敏度，可能檢出cfDNA中的低頻突變，使EGFR突變率升高。從EGFR分子分型來看，本研究cfDNA樣本比FFPE樣本中的T790M突變率高，但拷貝數擴增和19DEL突變率較低，提示游離血漿中DNA碎片化，可能影響小片段擴增或缺失突變的檢測。

EGFR基因檢測在肺癌臨床中主要用于指導靶向治療，但其突變分型特征和臨床應用價值尚缺少強有力的臨床研究。本文闡述了河南地區(qū)EGFR基因突變分型的突變率特征，結果表明，不同患者有不同的EGFR突變分型特征，同時，NGS檢測EGFR突變分型具有檢測面廣、靈敏度高、可同時檢測多種突變類型等優(yōu)勢，游離血漿也可作為組織樣本的有效補充。但本研究缺少臨床治療相關資料，未來還需臨床治療數據對EGFR分子分型的臨床意義進行驗證。