謝燕玲，寧喚喚，梁 璇，康 健，任 瑞，張 慧，張娜娜，路延之，柏銀蘭

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染引起的一種危害嚴(yán)重的慢性傳染病，是全球重點(diǎn)防控疾病之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2020年全球TB新發(fā)987萬人[1]。加強(qiáng)TB早期診斷有助于TB的預(yù)防和治療，因此，需要大力加強(qiáng)快速、敏感的TB診斷方法的研發(fā)。

TB診斷主要以臨床檢查和實(shí)驗(yàn)室診斷相結(jié)合，臨床檢查有胸部影像學(xué)和組織病理檢查，實(shí)驗(yàn)室診斷包括細(xì)菌培養(yǎng)、涂片染色、核酸檢測(cè)和抗原抗體檢測(cè)等[2]。在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中，Mtb培養(yǎng)陽性為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但存在耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)[3]。抗酸染色涂片陽性率較低，且不能區(qū)分Mtb及其他分枝桿菌。WHO推薦Xpert MTB/RIF技術(shù)用于TB快速診斷以及耐藥性的檢測(cè)，該技術(shù)仍存在易污染且無法區(qū)分活菌或死菌的不足[4]。在免疫診斷方法中，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(Tuberculin skin test，TST)是目前TB診斷運(yùn)用較廣泛的技術(shù)。TST以Mtb或卡介苗(BacilleCalmette-Guerin，BCG)培養(yǎng)物制成的結(jié)核菌素純蛋白衍生物(Purified protein derivative tuberculin，PPD)為診斷試劑，通過檢測(cè)皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Delayed-type hypersensitivity，DTH)輔助診斷TB。由于PPD包含分枝桿菌屬共同抗原，因此，TST不能區(qū)分Mtb感染、BCG接種和非結(jié)核分枝桿菌(Non tuberculosis mycobacteria，NTM)感染[5]。BCG在制備過程中丟失多個(gè)基因區(qū)，稱為差異編碼區(qū)(Regions of difference，RD)，其編碼的蛋白僅存在于致病性分枝桿菌中。以Mtb RD區(qū)編碼抗原體外刺激外周血單核細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ水平輔助TB診斷，稱為γ-干擾素釋放試驗(yàn)(Interferon-γ release assay，IGRA)，是目前WHO推薦的免疫學(xué)診斷方法。RD區(qū)編碼的抗原如ESAT-6、CFP10和MPT64等僅存在于Mtb中，因此，作為診斷試劑具有更高的特異性[6]。

MPT64是由Mtb的RD2基因座中Rv1980c(mpt64)編碼的差異蛋白，主要存在于Mtb，以及少數(shù)牛分枝桿菌變異株和BCG Tokyo 172變異株，NTM少數(shù)菌株中如嗜血分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌和海分枝桿菌等含有MPT64同源序列，與Mtb MPT64的同源性為65.9%～67.1%[7]。研究表明，MPT64能誘導(dǎo)Mtb感染豚鼠產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)，還能誘導(dǎo)免疫小鼠IFN-γ分泌顯著增加[8]。因此，MPT64被認(rèn)為是TB早期快速診斷試劑研制的候選抗原之一?，F(xiàn)已建立qRT-PCR檢測(cè)mpt64基因[9]、ELISA試劑盒檢測(cè)MPT64抗體[10]；膠體金免疫層析法[11]和免疫PCR[12]檢測(cè)MPT64抗原等方法。目前市場(chǎng)上在售的抗MTP64抗體有LifeSpan Biosciences公司(aa24-228)和Abcam公司(ab193435)，但均為兔多克隆抗體。因此，本研究采用原核表達(dá)載體獲得純化的重組MPT64蛋白，以該蛋白免疫小鼠，制備抗MPT64的單克隆抗體(Monoclonal antibody，mAb)，為MPT64用于TB快速診斷試劑的進(jìn)一步研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21、DH5α菌株、小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0由本室保存；6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR清潔回收試劑盒購自Axygen公司；2×Taq PCR Mix、pMD19T載體等分子生物學(xué)試劑購自TaKaRa公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl beta-D-thiogalactoside，IPTG)、HAT和HT購自Sigma公司；Ni2+-NTA購自GE公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗體購自中杉金橋公司；其他常用生化試劑購自各生物公司。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 以Mtb H37Rv菌株基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)引物F：5′-CGC-CATATGGTGCGCATCAAGATCTTC-3′(下劃線為NdeI酶切位點(diǎn))和R：5′-CGCAAGCTTCTAGGCCAGCATCGAGTC-3′(下劃線為Hind III酶切位點(diǎn))擴(kuò)增mpt64編碼基因。用NdeI和Hind III酶切PCR產(chǎn)物，并與相同酶切的pET28a(+)載體用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆提取質(zhì)粒。分別進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定(擎科生物)。

1.3 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞。將陽性重組菌株接種至LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。按照1∶100的接種比例轉(zhuǎn)接新鮮培養(yǎng)液，在終濃度為1 mmol/L的IPTG作用下誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。制備菌體蛋白樣品，12% SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)。蛋白電泳后，將菌體蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜，以抗6×His mAb為一抗，Western blot法驗(yàn)證目的蛋白表達(dá)。重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體，采用Ni2+親和層析法純化重組蛋白，具體操作步驟參考課題組前期研究[13]。純化的重組蛋白BCA定量后，-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單克隆抗體的制備 純化的重組MPT64蛋白免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，初次皮下免疫抗原50 μg/只+弗氏不完全佐劑；間隔兩周，皮下免疫2次。第3次免疫抗原25 μg/只。免疫完成后4周，處死小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，兩者按照1∶5的比例進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞克隆出現(xiàn)后，取細(xì)胞上清以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)抗體滴度，挑選陽性克隆。對(duì)含有陽性克隆的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，直至獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。大量培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞，接種小鼠腹腔制備腹水。

1.5 單克隆抗體的純化 收集小鼠腹水，采用中壓液相色譜儀純化mAb。用平衡液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)平衡HilTrap Protein A HP柱，腹水以0.22 μm濾膜過濾后上柱結(jié)合，平衡液洗滌，然后以甘氨酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 2.7)洗脫抗體。分段收集洗脫液，用中和液(1 mol/L Tris-HCl，pH 9.0)調(diào)整抗體溶液pH至7.0。12% SDS-PAGE電泳分析抗體的純化。純化的mAb加入20%甘油，BCA定量后分裝，-80 ℃保存。

1.6 單克隆抗體相對(duì)親和力和亞類鑒定 間接ELISA法檢測(cè)抗體的相對(duì)親和力及其亞類。10 μg/mL MPT64蛋白包被，加入梯度稀釋的純化抗體孵育，二抗分別加入HRP-山羊抗小鼠IgG、IgG 1、IgG 2a、IgG 2b和IgG 3?？贵w的相對(duì)親和力計(jì)算參考文獻(xiàn)[14]，具體如下：繪制以mAb濃度為橫坐標(biāo)，OD450為縱坐標(biāo)的曲線，曲線上升至趨于平坦段的OD450值為100%，取其OD450值為50%時(shí)的mAb濃度表示相對(duì)親和力。

1.7 單克隆抗體特異性檢測(cè) 分別制備Mtb H37Rv(毒株)、Mtb H37Ra(減毒株)、BCG、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis，Ms)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)的菌體蛋白。12% SDS-PAGE電泳后，蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，分別加入稀釋的抗MPT64 mAb、HRP-山羊抗小鼠IgG二抗，Western blot 法檢測(cè)mAb的特異性。

2 結(jié) 果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定mpt64基因大小為687 bp，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增出預(yù)期大小一致的特異性條帶(圖1A)。將該片段克隆入pET28a(+)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒，酶切鑒定顯示與預(yù)期mpt64大小一致的條帶(圖1B)。測(cè)序結(jié)果表明，插入序列與Mtb H37Rv株基因組mpt64公布的序列完全一致，表明mpt64原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pET28a(+)-mpt64。

A：PCR擴(kuò)增；B：酶切鑒定；M：DNA Maker圖1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of the prokaryotic expression vector

2.2 目的蛋白的表達(dá)與純化 天然MPT64的理論分子量為22 kDa，pET28a(+)-mpt64表達(dá)的蛋白帶有6×His標(biāo)簽，分子量約為25 kDa。12% SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，含有重組質(zhì)粒pET28a(+)-mpt64的細(xì)菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白，約25 kDa處出現(xiàn)表達(dá)蛋白條帶(圖2A)。Western blot分析顯示，重組菌株在25 kDa處有與抗His mAb結(jié)合的條帶(圖2B)，表明成功表達(dá)MPT64蛋白。采用Ni2+親和層析法純化目的蛋白，電泳分析結(jié)果顯示獲得了純化的MPT64重組蛋白(圖2C)。

A：MPT64表達(dá)的SDS-PAGE分析；B：Western blot鑒定；C：目的蛋白的純化；M：蛋白Maker；1：未誘導(dǎo)菌體蛋白；2：誘導(dǎo)菌體蛋白；3：純化的MPT64蛋白圖2 MPT64的表達(dá)與純化Fig.2 Expression and purification of MPT64

2.3 單克隆抗體的制備、純化及鑒定 通過有限稀釋法篩選并獲得一株能夠穩(wěn)定分泌抗MPT64 mAb的雜交瘤細(xì)胞，命名為MPT64-A5B2。收集該雜交瘤細(xì)胞制備的小鼠腹水，中壓液相色譜儀純化MPT64-A5B2 mAb。mAb加入loading buffer后直接進(jìn)行12% SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示相對(duì)分子量約150 kDa(圖3A)；將樣品煮沸后電泳，則分為重鏈(約50 kDa)、輕鏈(約25 kDa)(圖3B)，與免疫球蛋白IgG的分子量大小一致。Western blot檢測(cè)顯示，mAb能夠特異性識(shí)別純化的MPT64重組蛋白，表明純化獲得了MPT64-A5B2 mAb(圖3C)。

A：SDS-PAGE分析未煮mAb樣品；B：SDS-PAGE分析煮沸mAb樣品；C：Western blot分析；M：蛋白Maker；1：上樣前平衡液；2：上樣后平衡液；3：純化的mAb；4、5：煮沸變性后的mAb圖3 MPT64-A5B2 mAb的制備及純化Fig.3 Preparation and purification of MPT64-A5B2 mAb

2.4 單克隆抗體相對(duì)親和力及抗體亞類 ELISA檢測(cè)MPT64-A5B2 mAb相對(duì)親和力，如圖4A，曲線上升至趨于平坦時(shí)的OD450值為0.704，記作100%，其OD450值為50%時(shí)的mAb濃度約為2.813×10-7g/mL，表明所得抗體相對(duì)親和力較高。檢測(cè)mAb的IgG亞類，結(jié)果顯示該mAb屬于IgG 1亞類，κ型輕鏈(圖4B)。

A：mAb相對(duì)親和力；B：mAb亞類圖4 MPT64-A5B2 mAb的親和力及亞類檢測(cè)Fig.4 Affinity and subclasses of MPT64-A5B2 mAb

2.5 單克隆抗體的特異性檢測(cè) Western blot結(jié)果顯示，MPT64-A5B2 mAb可特異性識(shí)別Mtb H37Rv和H37Ra菌體中22 kDa的天然MPT64蛋白；BCG在傳代過程中丟失mpt64基因，Ms與Mtb MPT64的同源性僅為43.6%，而SA中無mpt64編碼基因，因此無特異識(shí)別條帶。純化的重組MPT64蛋白為陽性對(duì)照(約25 kDa)。表明獲得的MPT64-A5B2 mAb可區(qū)分Mtb、BCG和Ms，具有良好的特異性(圖5)。

M：蛋白Maker；1：MPT64純化蛋白；2：Mtb H37Rv菌體蛋白；3：BCG菌體蛋白；4：MS菌體蛋白；5：SA菌體蛋白；6：Mtb H37Ra菌體蛋白圖5 MPT64-A5B2 mAb特異性分析Fig.5 Specificity analysis of MPT64-A5B2 mAb

3 討 論

全球TB的高感染率和死亡率已引起公共衛(wèi)生領(lǐng)域極大的重視。敏感且特異的早期快速診斷方法，有助于TB的控制。MPT64在TB感染動(dòng)物體內(nèi)可引發(fā)DTH反應(yīng)，MPT64也可刺激TB患者外周血單核細(xì)胞IFN-γ釋放量明顯高于BCG免疫者[15]。因此，MPT64可用于TB的特異診斷試劑，且具有較高的特異性。

Mtb感染可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種抗體。通過抗原-抗體檢測(cè)方法檢測(cè)機(jī)體抗Mtb特異性抗體，具有特異性好、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。以抗Mtb IgG和IgA作為檢測(cè)抗體，ELISA法檢測(cè)患者血清，發(fā)現(xiàn)IgG診斷敏感性和特異性為76%和60%，IgA診斷敏感性和特異性為90%和71%[16]。目前用于TB診斷的抗原有pstS1(又稱38 kDa蛋白)、Ag85復(fù)合物、HspX(又稱16 kDa蛋白)[17]、ESAT-6、CFP10、MPT64、脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan，LAM)等。Ma等[18]以抗Mtb IgM包被ELISA板，建立間接ELISA檢測(cè)法，發(fā)現(xiàn)采用ESAT-6、CFP-10、MPT64等蛋白作為檢測(cè)抗原可區(qū)分TB患者與健康人，且MPT64的特異性(90.7%)高于ESAT-6(87.9%)和CFP-10(81.7%)。Xiao等[19]以MPT64作為抗原分別以酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(Enzyme-linked immunospot assay，ELISpot)和ELISA檢測(cè)TB患者樣品，結(jié)果顯示ELISpot檢測(cè)敏感性和特異性分別為66.67%和70%，ELISA檢測(cè)敏感性為73.81%。因此，本研究構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a(+)-mpt64，誘導(dǎo)重組菌表達(dá)并純化獲得MPT64蛋白，該重組MPT64蛋白可用于Mtb抗體檢測(cè)試劑盒的研究。

鑒定Mtb及其組分可以作為TB快速診斷方法。Sakashita等[20]分別采用Xpert MTB/RIF、抗酸染色法和鼠抗MPT64 mAb ELISA法檢測(cè)患者痰液，抗MPT64 mAb ELISA法的敏感性(88%)高于Xpert MTB/RIF(84%)和抗酸染色法(84%)?？筂PT64 mAb ELISA法檢測(cè)TB患者治療14 d和28 d后血清，發(fā)現(xiàn)MPT64抗原含量隨著抗TB治療而降低，且該方法在3種檢測(cè)方法中敏感性和特異性均最高[20]。Ida等[21]將兔CFP-10多克隆抗體(Polyclonal antibody，pAb)和豚鼠抗MPT64 pAb與金納米顆粒結(jié)合，檢測(cè)TB患者腦脊液、胸膜液和腹水，發(fā)現(xiàn)該方法診斷肺結(jié)核(89.3%)和肺外TB患者(78.1%)的敏感性顯著高于Xpert MTB/RIF基因診斷技術(shù)，特異性高達(dá)97.9%～98.3%。肺外TB患者腦脊液檢測(cè)中，基于抗MPT64 pAb為檢測(cè)試劑的MPT64抗原檢測(cè)試劑盒的陽性檢出率(83%)高于Xpert MTB/RIF(67%)[22]。而Xpert MTB/RIF和MPT64檢測(cè)的結(jié)合可以提高靈敏度[23]。有研究者使用38 kDa蛋白、ESAT-6、MPT64和Ag85復(fù)合物的mAb進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腸TB患者腸道組織中MPT64表達(dá)率為40.48%，顯著高于38 kDa蛋白、ESAT-6和Ag85復(fù)合物[24]。本研究獲得了一株能夠穩(wěn)定分泌抗MPT64 mAb的雜交瘤細(xì)胞系MPT64-A5B2。MPT64-A5B2 mAb相對(duì)親和力約為2.813×10-7g/mL，能特異性識(shí)別Mtb H37Rv和H37Ra中的MPT64蛋白，而與疫苗株BCG以及NTM無交叉反應(yīng)。基于mAb的測(cè)定可有效避免pAb檢測(cè)所存在的批次間差異缺點(diǎn)，且所獲得的MPT64-A5B2 mAb具有較好的特異性。MPT64基因在8種Mtb臨床菌株中有63 bp(66-86 aa)的缺失，Xiao等[19]研究發(fā)現(xiàn)MPT64基因多態(tài)性對(duì)宿主免疫反應(yīng)的影響不大。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)MPT64抗原人B細(xì)胞表位共9個(gè)，MPT64臨床菌株缺失區(qū)域僅累及B細(xì)胞表位中的2個(gè)(IEDB ID：103145和432168)。本課題組進(jìn)一步將對(duì)MPT64-A5B2 mAb抗體識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，并收集相應(yīng)突變的臨床菌株進(jìn)行檢測(cè)，為該mAb用于TB診斷試劑的研制提供依據(jù)。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，兔源抗HspX pAb通過適配體聯(lián)合免疫吸附法(Aptamer linked immobilized sorbent assay，ALISA)可診斷胸腔積液(靈敏度可達(dá)93%)[25]，而人源HspX mAb對(duì)耐多藥TB患者具有保護(hù)作用[26]。MPT64是Mtb短期或繁殖期培養(yǎng)分泌的主要抗原之一，占濾液總蛋白的8%，營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境時(shí)MPT64表達(dá)下調(diào)，且MPT64與巨噬細(xì)胞炎癥小體激活和凋亡相關(guān)[27]。因此，MPT64可能在Mtb感染早期起重要作用。本課題組將進(jìn)一步建立動(dòng)物感染模型，評(píng)價(jià)MPT64-A5B2 mAb用于阻斷Mtb感染的緊急預(yù)防性治療的研究。

利益沖突：無

引用本文格式：謝燕玲，寧喚喚，梁璇，等. 結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白MPT64單克隆抗體的制備及其特異性[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(5)：387-393. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.052