曹 旭，賈朝霞，劉 浩，王 靜，劉開揚

長期以來，由于各種原因使得機體被感染而產(chǎn)生炎癥后導致全身多器官衰竭的問題一直困擾著臨床工作者。而炎癥的產(chǎn)生與炎性小體有密切聯(lián)系。其中NLRP3炎性小體作為眾多炎性小體中的一種，廣泛參與多種病毒引起的炎癥反應。各種病毒感染宿主細胞時，不同炎性小體的激活是宿主抗病原體感染所必需的。宿主受病原體刺激后能誘導NLRP3炎性小體的組裝與活化，隨后激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)，處在活化狀態(tài)的caspase-1誘導下游相應促炎因子的剪切、成熟與分泌，進而參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。臨床上促使炎癥發(fā)生的致炎因子有多種，包含生物性因子(如細菌、病毒、真菌等)、物理性因子(如高溫、低溫、放射性物質(zhì)及紫外線等)、化學性因子(如強酸、強堿等)、異物(如碎屑、塵埃顆粒及手術縫線等)、壞死組織等[1]。其中，生物性因子中的病毒感染越來越多，如HIV感染最終導致全身免疫系統(tǒng)被攻擊，機體進行免疫預防及免疫清除的能力明顯下降，機體由于無法及時發(fā)現(xiàn)和清除病原體的入侵而造成嚴重感染以及腫瘤發(fā)生率明顯增加。過去的10年，NLRP3炎性小體作為一個非常關鍵的先天免疫成分在協(xié)調(diào)宿主免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮的作用不容小覷。因此，深入研究病毒感染時NLRP3炎性小體的激活途徑和調(diào)控機制，對于我們從根本上阻止病毒入侵、復制，進而控制炎癥的發(fā)生發(fā)展至關重要。

1 NLRP3炎性小體的結構

NLRP3炎性小體是由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)以及pro-caspase-1組成的復合物。其中，NLRP3蛋白由C端的亮氨酸重復序列(LRR)、N端的效應結構域以及中間段的核苷酸寡聚化結構域(NACTH)組成，且各部分都有其相應的功能，比如C端的亮氨酸重復序列能識別病原微生物及內(nèi)源性的危險信號；N端的效應結構域主要包括熱蛋白結構域(PYD)、胱天蛋白酶募集結構域(CARD)等，介導了信號傳導過程；中間段核苷酸寡聚化結構域促使NLR寡聚化。NLRP3炎性小體中的ASC作為中間部分起到了連接NLRP3和pro-caspase-1的作用，ASC由PYD和CARD兩部分組成，其中PYD能與NLRP3蛋白的PYD相互作用，CARD能招募pro-caspase-1進而介導NLRP3激活，形成具有酶活性的caspase-1[2-3]。

2 NLRP3炎性小體的激活

當細胞處于靜息狀態(tài)時，NLRP3炎性小體的各組成部分以及作用底物都處于一個極低水平不能被測及[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體的激活主要包括兩個過程,首先是啟動過程：Toll 樣識別受體(Toll-like receptor，TLR)識別相應配體，啟動核因子κB (Nuclear factor kappa-B，NF-κB)介導的信號通路，誘導pro-IL-1β、pro-IL-18 和NLRP3 的表達上調(diào)。其次是激活過程：該過程由細胞外ATP、成孔毒素或顆粒物等刺激導致NLRP3炎性小體的組裝、激活以及caspase-1經(jīng)活化后對下游促炎因子的加工修飾并最終導致其成熟分泌的過程[5]。在激活過程中，鉀離子外流、溶酶體破壞、線粒體損傷及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生是激活NLRP3炎性小體的關鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，病原相關分子模式以及損傷相關分子模式進入宿主體能夠促進NLRP3炎性小體的活化，如ATP、病原體相關RNA、晶體或微粒、細菌毒素及某些疫苗增強劑[6]。然而這些刺激未被證實直接與NLRP3相互作用，由于其結構和化學上的差異性，懷疑它們誘導共同的細胞信號激活NLRP3炎性小體。目前，這一觀點得到了許多研究者的認可[7]。也有研究認為在NLRP3炎性小體的活化過程中，宿主體內(nèi)的某些激酶發(fā)揮了作用，如半胱氨酸激酶，但這一觀點目前尚未達成共識[8-9]。最近的研究有了重大進展，發(fā)現(xiàn)了一種新的激酶與NLRP3炎性小體激活相關。NEK7，一種已知參與有絲分裂的絲氨酸激酶，其對NLRP3炎性小體的激活至關重要，能特異性的與NLRP3相互作用，且與其他炎性小體無關。

3 病毒感染對NLRP3炎性小體的激活機制

3.1 病毒RNA介導的激活 研究發(fā)現(xiàn)，盡管DNA病毒的種類多于RNA病毒，但目前導致人類疾病的常見病毒則是RNA病毒。最初就有研究者認為，NLRP3炎性小體能被病毒核酸RNA所激活，并介紹了激活的途徑。隨后病毒RNA能激活NLRP3炎性小體這一觀點成為研究者們研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，將病毒RNA或其類似物注入到小鼠體內(nèi)或人巨噬細胞中能激活NLRP3炎性小體[10-11]。如從輪狀病毒中提取的dsRNA能激活NLRP3，從甲型流感病毒(Influenza A Virus，IAV)中提取的ssRNA也能激活NLRP3，進而啟動由NLRP3介導的炎性小體的激活[12]。另有文獻稱，將雙鏈RNA類似物poly(I：C)注入小鼠體內(nèi)，它能刺激小鼠體內(nèi)IL-1β分泌增加，且這種炎癥反應是由NLRP3介導產(chǎn)生的[13]。盡管這些發(fā)現(xiàn)都與NLRP3分子有關，但病毒RNA并不是與NLRP3直接結合來啟動炎性小體的活化。其激活過程為病毒RNA首先被模式識別受體(TLRs或NLRs)識別，隨后通過NF-κB介導的信號途徑上調(diào)pro-IL-18和pro-IL-1β和NLRP3分子的表達，然后啟動NLRP3炎性小體的激活[14]。RNA活化蛋白激酶(RNA-activated protein kinase, PKR)在該激活過程中也起到了一定作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，細胞受到poly(I:C)等多種刺激后，PKR能發(fā)生自磷酸化，直接與NLRP3分子相互作用，進而調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體的活化，但目前此觀點備受爭議[15]。有研究者稱使用PKR抑制劑2-氨基嘌呤處理小鼠后，小鼠體內(nèi)炎性小體的激活程度減弱，所以相關研究者認為PKR在NLRP3炎性小體的激活中發(fā)揮了一定的作用[16]。然而，另有研究者認為PKR在炎性小體的激活中并沒有發(fā)揮作用。實驗對PKR缺陷的的雜合子小鼠和PKR缺陷的純合子小鼠同時用NLRP3的激活劑進行刺激，發(fā)現(xiàn)在炎性小體激活方面并無差異。因此，對于PKR在NLRP3炎性小體激活中的作用需要進一步深入研究[17]。

以上是病毒RNA激活NLRP3炎性小體的主要方式。研究還發(fā)現(xiàn)病毒RNA激活炎性小體的另一種方式。RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)即維甲酸誘導基因蛋白I，其屬于維甲酸誘導基因I樣受體家族(RLRs),同樣是一種胞內(nèi)模式識別受體，具有識別病毒RNA的作用。其過程為RIG-I識別病毒RNA后能與ASC和caspase-1結合，啟動NLRP3炎性小體激活，該途徑并無NLRP3參與介導[18]。這種激活炎性小體的方式限于某些病毒感染，如水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)[19]。研究也發(fā)現(xiàn)腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)能借助RLRs家族中的另一個成員黑色素瘤分化相關抗原5(melanoma differentiation-associated gene 5, MDA5)，作為胞內(nèi)的一種模式識別受體識別病毒RNA，通過激活NF-κB途徑啟動依賴NLRP3的炎性小體的活化[20-21]。近期，有學者發(fā)現(xiàn)在正常人的支氣管上皮細胞中RIG-I能與ASC及caspase-1相互作用來調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體活化。該研究還進一步發(fā)現(xiàn)RIG-I能在轉錄水平上對NLRP3及促炎因子IL-1β的前體進行調(diào)節(jié)，提示RIG-I具有啟動和激活炎性小體的雙重作用[22]。然而另有研究表明，在少數(shù)病毒如風疹病毒(Rubella virus, RV)感染中，RIG-I辨別RV的RNA后，RIG-I沒有直接參與炎性小體的活化，其具體的參與機制有待后續(xù)的探索[23]。

3.2 病毒感染致宿主細胞狀態(tài)變化介導的激活 病毒感染過程中會引起宿主細胞狀態(tài)發(fā)生一系列變化，如細胞內(nèi)離子濃度異常、溶酶體破壞和線粒體功能障礙等，這些變化會被宿主感應為危險信號進而導致NLRP3炎性小體的激活。

細胞內(nèi)外各種離子保持適當?shù)奶荻仁蔷S持宿主細胞穩(wěn)態(tài)的前提。如靜息狀態(tài)下，細胞內(nèi)K+濃度約是胞外K+濃度的30倍，而胞外Na+濃度約是胞內(nèi)Na+濃度的15倍[24]。相反，一旦這種穩(wěn)態(tài)被打破，NLRP3轉錄體將感知到危險信號，上調(diào)NLRP3炎性小體組分的表達，隨后組裝激活NLRP3炎性小體。如被熟知的K+外排能激活NLRP3炎性小體事件，在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染巨噬細胞中得到了證實[25]。此外，離子濃度的紊亂會導致線粒體損傷和 ROS 的產(chǎn)生，從而增強 NLRP3 炎性小體的激活[26]。

溶酶體破壞會導致內(nèi)容物組織蛋白酶B的釋放，隨后誘導ROS產(chǎn)生，刺激NLRP3炎性小體激活。如腺病毒(Adenovirus,ADV)感染誘導溶酶體破壞和組織蛋白酶B的釋放，從而激活NLRP3炎性小體[27]。IAV感染通過誘導溶酶體酸化來激活 NLRP3 炎性小體[28]。此外，NLRP3 炎性體激活也需要 ROS，因為在NADPH 氧化酶抑制劑或氧清除劑 N-乙酰半胱氨酸存在的情況下觀察到較低水平的 IL-1β[29]。

線粒體損傷也是NLRP3炎性小體激活的關鍵因素。其同樣誘導ROS產(chǎn)生促使NLRP3炎性小體激活。一項研究報道，病毒感染后促使RIP1-RIP3復合物組裝隨后誘導GTP酶DRP1激活。而DRP1能轉移到線粒體調(diào)節(jié)其異常功能和致使線粒體損傷[30]。另有幾項研究發(fā)現(xiàn)，多種病毒及RNA類似物激活NLRP3炎性小體都依賴于RIP1-RIP3-DRP1通路。如水皰性口炎病毒(VSV)、仙臺病毒(Sendai Virus，SeV)、登革熱病毒及poly(I：C)[31]。此外，線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)在病毒感染的情況下將腫瘤壞死因子受體作用因子3(TRAF3)招募到ASC，泛素化的ASC促進NLRP3寡聚，從而增強NLRP3炎癥小體的激活[32]。NLRP3還顯示在病毒感染期間與線粒體融合蛋白2直接相關[33]。然而，有報道認為，線粒體損傷引起的活性氧對于激活線粒體內(nèi)的NLRP3不是必需的。相反，由EMCV感染誘導的線粒體膜電位是激活NLRP3 炎性小體所必需的。在適當?shù)木€粒體膜電位作用下，NLRP3轉運至線粒體，與線粒體融合蛋白2結合,進而促使NLRP3炎性小體活化[34]。

病毒感染過程中，無論是溶酶體破壞還是線粒體損傷均誘導ROS產(chǎn)生。由此可見，ROS產(chǎn)生對NLRP3炎性小體激活起到了一定作用。已有研究證明了有些病毒依賴ROS的產(chǎn)生激活NLRP3炎性小體。如在HCV感染的細胞中加入ROS的清除劑，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體的激活受到抑制，提示ROS對NLRP3炎性小體的激活起正調(diào)節(jié)作用[35]。而對于ROS在NLRP3炎性小體激活中的具體作用仍需要探討。

3.3 病毒孔蛋白介導的激活 除上述常見激活機制外，研究還發(fā)現(xiàn)有少數(shù)病毒能借助孔蛋白激活NLRP3炎性小體。病毒孔蛋白為病毒編碼的離子通道蛋白，可與宿主細胞膜相互作用形成選擇性離子通道，介導特殊離子(如Na+，K+，Ca2+，Cl-1)的運輸，輔助病毒進入宿主細胞，進而激活炎性小體，促進炎癥的發(fā)生。如甲型流感病毒(IAV)編碼的質(zhì)子特異性離子通道M2蛋白能促使酸化的高爾基體釋放氫離子，導致高爾基體H+濃度失衡來啟動NLRP3炎性小體的激活[36]。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)表達的SH蛋白能聚集在宿主細胞高爾基體的脂筏結構中，形成離子通道，進而誘導NLRP3從胞質(zhì)移向高爾基體，觸發(fā)炎性小體的激活[37]。腦心肌炎病毒編碼的2B蛋白，定植于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，能使宿主細胞細胞器中的鈣離子濃度下降，進而促使NLRP3炎性小體的組裝和IL-1β的分泌。這一結論已在鼠骨髓來源的巨噬細胞中得到證實。但2B蛋白對NLRP3炎性小體激活過程的具體途徑有待進一步探索[38]。同樣，近年來已經(jīng)被證實的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)，其亞基因組RNA編碼的E蛋白能誘導細胞內(nèi)離子濃度失衡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，進而導致NLRP3炎性小體的激活。研究顯示，E蛋白能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體中間腔或高爾基體膜中形成鈣離子通道，并激活NLRP3炎性小體[39]。

綜上所述，當病毒感染時，NLRP3炎性小體的激活機制，如圖1所示。

圖1 病毒感染時NLRP3炎性小體激活路徑模式圖Fig.1 NLRP3 inflammasome activation pathway during viral infection

4 病毒感染負向調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體活化

病毒不僅能通過編碼相應的孔蛋白激活NLRP3炎性小體，然而研究發(fā)現(xiàn)，病毒編碼的非結構蛋白能與炎性小體激活途徑中的關鍵蛋白直接結合來抑制NLRP3炎性小體的激活。如麻疹病毒(Measles virus,MV)編碼的V蛋白能與NLRP3蛋白直接結合來抑制NLRP3炎性小體的活化，其機制可能是通過阻礙NLRP3炎性復合體的組裝過程進而抑制了炎性小體的活化。腸道病毒71型(Enterovirus type 71,EV-71)編碼的2A和3C蛋白酶能對NLRP3蛋白進行切割以抑制NLRP3炎性小體的激活[41]。SARS-CoV-2基因組RNA翻譯的非結構蛋白NSP1和NSP13，能顯著抑制NLRP3炎性小體的活化。其機制可能是通過下調(diào)NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β等組分的表達來干擾NLRP3炎性小體的激活[42]。

病毒感染時，病毒不僅通過自身組分干擾NLRP3炎性小體的激活以逃避機體的免疫應答，近期有學者稱，宿主的線粒體自噬也能抑制NLRP3炎性小體的激活。在自噬系統(tǒng)缺陷的小鼠血清中發(fā)現(xiàn)，IL-18、IL-1β含量明顯升高，表明線粒體自噬對NLRP3炎性小體起負調(diào)控作用，因此，病毒感染自噬系統(tǒng)缺陷的小鼠可能更難以逃避機體的免疫應答機制[43]。

5 結語與展望

NLRP3炎性小體的激活對機體正常發(fā)揮免疫應答，防御病原體入侵至關重要。一方面，NLRP3炎性小體激活過程受阻，機體對外界病原體的侵襲不能及時或有效的產(chǎn)生應答，病原微生物不能被清除，從而導致機體感染。另一方面，NLRP3炎性小體過度激活，機體產(chǎn)生過量的炎性因子導致細胞過度焦亡以及嚴重的病理損傷。大部分的研究顯示，相對NLRP3炎性小體的抑制機制而言，其激活更利于機體免疫功能的正常發(fā)揮，對宿主具有保護作用。實驗用IAV感染NLRP3、ASC、caspase-1基因敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠的死亡率明顯升高。提示NLRP3炎性小體在病毒感染機體時發(fā)揮了保護宿主的作用。

病毒感染與NLRP3炎性小體之間存在復雜的生物學關系。NLRP3分子作為一種病毒炎癥信號(如病毒RNA或病毒離子孔道蛋白)的識別受體，在NLRP3炎性小體激活中發(fā)揮重要作用。 宿主細胞內(nèi)NLRP3蛋白識別病毒炎癥信號，誘導炎性復合體組裝并觸發(fā)其激活，促使下游炎性因子產(chǎn)生，抑制病毒在宿主細胞內(nèi)繁殖，發(fā)揮抗病毒作用。同時，病毒也能依賴自身基因組編碼的非結構蛋白，抑制NLRP3炎性小體的組裝及活化，以逃避機體的免疫應答機制。雖然一些研究已經(jīng)證實了某些病毒感染時，能刺激機體NLRP3炎性小體激活，然而我們對NLRP3炎性小體參與抗病毒免疫的復雜機制以及在激活過程中是否有其他分子參與還不完全了解。 因此，從分子水平深入研究病毒感染與NLRP3炎性小體之間的復雜機制，有利于我們從根本上控制病毒在宿主細胞中復制，為臨床抗病毒感染、治療及藥物研發(fā)提供新的策略。

利益沖突：無

引用本文格式：曹旭，賈朝霞，劉浩，等. 病毒感染與NLRP3炎性小體[J].中國人獸共患病學報，2022，38(5)：458-463. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.056