房延鳳 馬李杰 南巖東 張濤 任騰 蘇蔚 劉雁聲 惠盼 譙鈺琪金發(fā)光 劉偉

1空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，西安710038；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，成都610083

非小細胞肺癌占肺癌的85%[1]，5年生存率約13%[2]。以EGFR酪氨酸酶抑制劑為代表的分子靶向治療較化療顯著延長了患者無進展生存期。研究表明，EGFR-TKI治療敏感性最高的經(jīng)典突變?yōu)?9外顯子的缺失突變和21外顯子的L858R點突變[3-4]，其中L858R點突變占EGFR突變的40%～45%[5]。罕見突變占EGFR突變陽性NSCLC患者的7%～23%[6-8]，而21外顯子上的少見突變L861Q約占2%[9]，且突變臨床特征和對EGFR-TKI治療的敏感性研究數(shù)據(jù)不多，有研究發(fā)現(xiàn)L861Q對EGFR-TKI治療敏感性僅次于經(jīng)典突變[10-12]，但部分研究顯示L861Q呈低水平的敏感性[13]，甚至對EGFR-TKI治療的完全抵抗[14]，療效不佳[15]。本研究回顧性分析498例非小細胞肺癌患者通過ARMS法檢測其EGFR基因上21外顯子的L861Q、L858R2個突變位點，分析其突變臨床特征及兩者突變率的對比研究，有助于進一步總結歸納本地區(qū)非小細胞肺癌21外顯子突變臨床特征，構建基因突變臨床特征模型。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年7月至2018年12月空軍軍醫(yī)大學空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科確診的非小細胞肺癌705例，包括腺癌464例，其他類型241例。其中男448例，女257例；年齡(65.96±12.36)歲。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2 設備與方法

1.2.1 主要儀器和試劑 熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司，LightCycler480II)，臺式高速離心機(美國Thermo公司，PICO17)，核酸蛋白定量儀(美國Invitrogen公司，Qubit2.0)，三孔電熱恒溫水槽(上海齊欣科學儀器有限公司，DK-8D)等。組織&血液DNA提取純化試劑盒(德國QIAGEN公司，CatNo./ID：69504)，石蠟組織DNA提取純化試劑盒(德國QIAGEN公司，Cat No./ID：56404)外周血游離核酸提取純化試劑盒(德 國QIAGEN公 司，CatNo./ID：55114)，EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)(蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2.2 核酸純化 (1)胸水和新鮮組織：處理好樣本之后，按照DNesasy?Blood&Tissue Kit(QIAGEN)流程純化核酸。(2)外周血：采集患者化療前或化療后4周外周血8～10 ml(EDTA抗凝)，按照QIAamp?Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)流程純化ctDNA。(3)石蠟組織：取石蠟組織切片3～5μm厚，5～10片，按照QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)流程純化核酸。

1.2.3 EGFR基因突變檢測 于實時熒光定量PCR平臺，用突變特異擴增PRCR和溶解曲線分析技術檢測基因特定突變。

1.2.4 結果判讀 陽性樣本指有典型S型擴增曲線，且某個位點的ΔCt值在切值范圍內(nèi)，同時該位點的溶解峰形的Tm值與STD該位點溶解峰形的Tm值的差值絕對值小于或等于1。

1.3 統(tǒng)計學分析 用SPSS 26.0軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料以x-±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(%)表示，組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 入選患者Exon21外顯子上L858R、L861Q突變情況 705例非小細胞肺癌中Exon21外顯子上L858R、L861Q共突變80例，突變率11.348%，男性共突變31例，男性突變率6.920%，女性共突變49例，女性突變率19.066%。

2.2 L861Q、L858R突變臨床特征對比

2.2.1 L861Q突變臨床特征 705例非小細胞肺癌中L861Q突變13例，突變率1.844%；其中腺癌突變率高于其他病理類型，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。L861Q突變特征還表現(xiàn)在：年齡≥50歲組突變率高于年齡＜50歲組、女性組突變率高于男性組，不吸煙組突變率高于吸煙組，右肺腫瘤組突變率高于左肺腫瘤組，合并其他腫瘤組中僅13例腺癌未合并其他腫瘤患者突變，Ⅰ～Ⅲ期組突變率高于Ⅳ期組，并發(fā)骨、頭顱轉移組突變率高于相應的無轉移組，無胸膜及淋巴結轉移組突變率高于相應轉移組，合并糖尿病、高血壓組突變率高于未合并糖尿病、高血壓組，但以上各項差異均無統(tǒng)計學意義(P值均＞0.05)，見表1。

2.2.2 L858R突變臨床特征 705例非小細胞肺癌中L858R突變67例，突變率95.035%。女性組突變率高于男性組(χ2=19.562，P＜0.001)，不吸煙組突變率高于吸煙組(χ2=15.859，P＜0.001)，右肺腫瘤突變率高于左肺腫瘤(χ2=5.601，P=0.020)，腺癌組突變率高于非腺癌組(χ2=16.282，P＜0.001)，Ⅳ期組腫瘤突變率高于Ⅰ～Ⅲ期組(χ2=5.996，P=0.016)，見表1。

2.2.3 L861Q與L858R突變特征對比 L861Q與L858R突變在性別、年齡、是否吸煙、病理分型、腫瘤發(fā)生部位、是否合并其它腫瘤、有無并發(fā)骨轉移突變臨床特征相一致；腫瘤分期，是否并發(fā)胸膜、淋巴結、頭顱轉移及有無合并糖尿病、高血壓突變臨床特征相反，以上差異均無統(tǒng)計學意義(P值均＞0.05)，見表1。

3 討論

本文705例非小細胞肺癌L861Q突變率略低于既往報道[9]，考慮與檢測方法有關。腺癌組L861Q、L858R突變率高于其它類型，差異有統(tǒng)計學意義，既往研究認為EGFR突變在鱗癌中偶然檢測到是對腺鱗癌或低分化癌的病例誤診[16]，本文中13例L861Q突變均發(fā)生于腺癌未合并其它腫瘤組，即21外顯子的突變更易發(fā)生于腺癌。既往報道EGFR少見突變與吸煙之間存在顯著關聯(lián)[17-18]。本文L858R不吸煙組突變率高于吸煙組，差異有統(tǒng)計學意義；L861Q不吸煙組突變率高于吸煙組，但差異無統(tǒng)計學意義，考慮一方面與L861Q突變率低有關，另一方面L861Q少見突變與吸煙是否相關需進一步擴大樣本量深入研究。腺癌患者L861Q突變率高于相應對照組，L858R突變率在非吸煙、女性、Ⅳ期、右肺、腺癌高于相應對照組，以上差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05)，表明L861Q、L858R突變及EGFR-TKI治療更傾向這種特征的患者。

國外有研究表明，腫瘤分期也會影響突變率。癌癥基因組圖譜隊列中報道EGFR突變率11%，其對象主要為非轉移性、手術切除的非小細胞肺癌，且未接受全身性的治療[19]。本研究中不同臨床分期的L861突變率Ⅰ～Ⅲ期組高于Ⅳ期組，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.057，P＞0.05)；L858R突變率Ⅳ期組高于Ⅰ～Ⅲ期組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.996，P＜0.05)，即EGFR常見突變L858R腺癌Ⅳ期更易出現(xiàn)。一方面考慮入選病例大部分是臨床分期，部分和術后分期存在一定差異，另一方面Ⅳ期腺癌患者無手術適應癥，基因檢測為首選，相比Ⅰ～Ⅲ期腺癌，Ⅳ期檢測比例更高，故而檢出常見突變L858R在Ⅳ期比例更高，后續(xù)需進一步深入研究。

表1 L861Q、L858R突變臨床特征對比

本研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)生于≥50歲不吸煙女性、右肺腺癌、未合并其他腫瘤、并發(fā)骨轉移者的L861Q突變率高于相應對照組，L858R突變率臨床特征與此相一致。而L861Q、L858R在腫瘤分期有無合并糖尿病、高血壓和是否并發(fā)頭顱、胸膜、淋巴結轉移突變率臨床特征相反，但差異均無統(tǒng)計學意義(P值均＞0.05)，L861Q、L858R突變臨床特征的一致性和相反性內(nèi)在機制還需進一步深入研究。據(jù)報道攜帶L858R突變的非小細胞肺癌EGFR-TKI療效優(yōu)于L861Q等少見突變的患者[20-28]，因此，L858R、L861Q突變的臨床特征和療效之間存在一定相關性。突變過程中有無其他通路同時激活的影響，如MDM2蛋白的產(chǎn)生[29]，需要大樣本進一步深入研究。鑒定非小細胞肺癌患者臨床特征為其接受EGFR-TKI治療療效預測提供了導向。

本研究未涉及復合突變及L861Q、L858R突變療效對比研究，罕見的突變可能單獨發(fā)生或與常見或罕見EGFR復合突變[30]，伴隨基因檢測技術的改進，少見突變的檢出率可能比以前更高[31]。通過705例非小細胞肺癌患者L861Q、L858R突變臨床特征研究，有助于進一步探索本地區(qū)21外顯子的突變臨床特征，優(yōu)化非小細胞肺癌個體化治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突