敦鑫龍，張 磊，高 明，陳 濤，鄭萬(wàn)祥，魏 迪，鞠東恩，侯廣東，陸 軍，孟 平，袁建林

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710032；2.延安大學(xué)附屬西安大興醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710016；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，陜西西安 710032)

早泄(premature ejaculation, PE)是臨床最常見(jiàn)的男性性功能障礙疾病之一，最新的國(guó)內(nèi)研究表明，PE患病率約為32%[1]。PE對(duì)于患者自身、家庭以及社會(huì)都有極大的負(fù)面影響。近年來(lái)隨著社會(huì)發(fā)展、人民生活水平日益改善，人們對(duì)性生活的要求逐漸提高，對(duì)PE的治療需求也逐漸增加。

目前在PE的基礎(chǔ)研究中，建模方式主要有藥物法[2]、電擊法[3]以及交配篩選法[4]。其中交配篩選模型篩選出的PE大鼠，更接近于臨床PE患者特點(diǎn)，越來(lái)越多地被運(yùn)用于早泄機(jī)制研究中[5]。然而，目前基于射精頻率(ejaculation frequency，EF)的交配篩選模型存在一些不足：例如相較于射精潛伏期(ejaculation latency，EL)，EF與早泄患者陰道內(nèi)射精潛伏期(intravaginal ejaculatory latency time，IELT)的關(guān)聯(lián)性較弱；再者，根據(jù)EF建立原發(fā)性早泄模型無(wú)法排除射精后間隔(post-ejaculatory interval, PEI)的影響，造成誤差等。

本研究基于WALDINGER等[6-8]提出的射精分布理論，進(jìn)行雌雄大鼠交配實(shí)驗(yàn)，依據(jù)EL建立原發(fā)性PE大鼠模型，并探究其可行性及優(yōu)勢(shì)，以期為早泄的相關(guān)研究提供更穩(wěn)定可靠的工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠84只、雌性50只，均為11周齡，SPF級(jí)。Wistar大鼠均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，并且飼養(yǎng)在空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障內(nèi)，溫度和濕度環(huán)境適宜[8∶00-20∶00光照，20∶00-次日8∶00黑暗，40%～50%濕度，(22±2)℃室溫]，飲水和攝食自由。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)至少1周。

1.2 藥品和儀器黃體酮注射液(10 mg/1 mL，杭州動(dòng)物藥品廠)、苯甲酸雌二醇注射液(4 mg/2 mL，杭州動(dòng)物藥品廠)，玉米油(R10106睿思科生物技術(shù)有限公司)，紅外影像系統(tǒng)(浙江大華技術(shù)股份有限公司)，(50×40×30)cm3觀察籠，常規(guī)外科手術(shù)器械一套。

1.3 動(dòng)物的處理

1.3.1雌鼠去勢(shì)手術(shù) 手術(shù)器械常規(guī)消毒，用7%的水合氯醛(0.4 mL/100 g)對(duì)雌鼠進(jìn)行腹腔麻醉。雌鼠俯臥位，在脊柱兩側(cè)，兩肋下緣與大腿根部之間，用剪刀剪去毛發(fā)后用碘伏消毒。縱向切開(kāi)約1 cm的切口，分離皮膚與皮下組織，切開(kāi)肌肉層約0.5 cm，打開(kāi)腹腔，用鑷子夾出脂肪組織。在脂肪組織中找到半徑約為0.4 cm的粉紅色卵巢(圖1)。沿卵巢根部結(jié)扎脂肪組織后切除卵巢，將剩余組織放回腹腔后，逐層縫合肌肉層、皮下組織及皮膚，在創(chuàng)口涂抹紅霉素軟膏以防感染。對(duì)側(cè)卵巢按照同樣的步驟進(jìn)行切除。術(shù)后注射50 000 U青霉素預(yù)防感染。放入恒溫復(fù)蘇箱中等待復(fù)蘇。雌鼠術(shù)后恢復(fù)約2周。

圖1 雌鼠去勢(shì)手術(shù)中的卵巢

1.3.2雌性大鼠激素誘導(dǎo)發(fā)情 為了進(jìn)行統(tǒng)一集中的交配實(shí)驗(yàn)，需要雌鼠同步發(fā)情。我們采用雌孕激素皮下注射的方式進(jìn)行誘導(dǎo)[9]。分別在交配實(shí)驗(yàn)前48 h和4 h，對(duì)雌鼠頸部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.05 mL(玉米油溶解，0.4 mg/mL)及黃體酮注射液0.05 mL(玉米油溶解，10 mg/mL)。

1.3.3雄鼠交配行為的習(xí)得 在正式交配實(shí)驗(yàn)前1周，雄性大鼠與激素誘導(dǎo)發(fā)情的雌性大鼠1∶1合籠1晚，以加快大鼠對(duì)于性行為的適應(yīng)和學(xué)習(xí)。

1.3.4大鼠交配的行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間為21∶00-次日1∶00，在黑暗的環(huán)境下進(jìn)行，每只大鼠每周1次，共6次，記錄后3周數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)步驟：關(guān)閉燈光，打開(kāi)紅外影像系統(tǒng)，將1只雄鼠放入觀察籠中，適應(yīng)5 min后，隨機(jī)挑選1只激素誘導(dǎo)的雌鼠加入，記錄1 h內(nèi)的交配過(guò)程。交配實(shí)驗(yàn)后，回放錄像，分析以下指標(biāo)。騎跨潛伏期(mount latency, ML):從雌鼠放入到雄鼠第1次前肢爬高到雌鼠背部的時(shí)間(若第1次騎跨即插入，則騎跨和插入潛伏期一致)；插入潛伏期(intromission latency, IL):從雌鼠放入到雄鼠第1次插入陰道的時(shí)間；EL：從雄鼠第1次插入到第1次射精的時(shí)間(射精時(shí)刻以雄鼠身體劇烈抖動(dòng)為準(zhǔn))；騎跨頻率(mount frequency, MF):從雌鼠放入到雄鼠第1次射精之間的騎跨次數(shù)；插入頻率(intromission frequency, IF):從雌鼠放入到雄鼠第1次射精之間的插入次數(shù)(射精時(shí)的插入不計(jì))；EF：1 h內(nèi)雄鼠的射精次數(shù)；PEI:雄鼠第1次射精到再次插入的時(shí)間間隔；插入比例(intromission ratio, IR): IR=IF/(IF+MF)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠性行為過(guò)程描述大鼠的性行為是一個(gè)連續(xù)規(guī)律的過(guò)程，經(jīng)歷嗅探、騎跨、插入、插入后舔陰、射精、射精后間隔等過(guò)程。嗅探(圖2A)：當(dāng)雌鼠加入時(shí)，雄鼠會(huì)嗅探雌鼠的陰部。騎跨(圖2B)：雄鼠前肢放在雌鼠的背部，雌鼠或有向下弓腰的動(dòng)作，整個(gè)過(guò)程持續(xù)大約1 s。插入(圖2C)：雄鼠前肢放在雌鼠背部，同時(shí)雌鼠向下弓腰，臀部翹起露出陰部，雄鼠胯部用力向前抖動(dòng)，插入過(guò)程持續(xù)約1 s。雄鼠插入后迅速后撤并舔舐自己的陰莖(圖2D)。射精(圖2E)：經(jīng)過(guò)多次的插入、后撤、舔陰過(guò)程后，雄鼠進(jìn)行一次劇烈的深插，身體劇烈抽動(dòng)后，前肢緩慢從雌鼠后背上抬起并張開(kāi)，雌鼠前撤，雄鼠在短暫停頓后舔舐自己的陰部。射精過(guò)程大約持續(xù)3～5 s。隨后進(jìn)入約5～10 min的射精后間隔(圖2F)。射精后間隔指雄鼠在射精后動(dòng)作減少或趴下休息，在此期間不論雌鼠有何引誘行為，雄鼠均無(wú)較大反應(yīng)。交配過(guò)程中，雌鼠會(huì)有一些引誘行為，如短促的跳躍、扭動(dòng)或咬扯等。圖2為大鼠交配過(guò)程的典型動(dòng)作圖。

A：嗅探；B：騎跨；C：插入；D：插入后舔陰；E：射精；F：射精后間隔。圖2 大鼠性行為過(guò)程典型動(dòng)作圖

2.2 不同表型大鼠性行為特征84只雄性大鼠中，有30只大鼠在交配實(shí)驗(yàn)中因無(wú)法完成完整的性行為過(guò)程(ML、IL或插入間隔過(guò)長(zhǎng)且未射精)或不穩(wěn)定(即交配實(shí)驗(yàn)中3周的EF相差大于2)而被排除。

2.2.1EF建模方式 54只雄性大鼠，繪制EF的頻率分布直方圖，可以看出EF近似呈正態(tài)分布：EF～N(μ,σ2)(3.76,1.402)。P-P圖顯示EF分布的正態(tài)性較強(qiáng)(圖3)。

圖3 EF頻率分布直方圖(A)及正態(tài)P-P圖(B)

根據(jù)EF分布及10%[6]原則，將大鼠分為快速射精組(EF<3)、正常射精組(3≤EF≤5)及遲緩射精組(EF>5)，各組分別為5、41、8只，3組大鼠的EL明顯遞增(P<0.01)、EF明顯遞減(P<0.01)，其他參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中ML與IL兩指標(biāo)進(jìn)一步多重比較結(jié)果顯示各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 EF建模方式中快速射精組、正常射精組及遲緩射精組雄鼠的性行為學(xué)特征

2.2.2EL建模方式 剩余54只雄性大鼠，繪制EL的頻率分布直方圖，可以看出EL近似呈正態(tài)分布：EL～N(μ,σ2)(1016.89,483.9662)。P-P圖顯示EL分布的正態(tài)性較強(qiáng)(圖4)。

圖4 EL頻率分布直方圖(A)及正態(tài)P-P圖(B)

根據(jù)正態(tài)分布的概率分布規(guī)律可知，EL在(μ-σ,μ+σ)區(qū)間概率較大，為68.27%。故我們將EL<μ-σ定義為快速射精組，μ-σ≤EL≤μ+σ定義為正常射精組。EL>μ+σ定義為遲緩射精組將54只大鼠根據(jù)EL分組，分別為9、36、9只，三組大鼠的EL明顯遞增(P<0.01)、EF明顯遞減(P<0.01)、IF和PEI有不同程度的差異，而MF、ML、IL以及IR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 EL建模方式中快速射精組、正常射精組及遲緩射精組雄鼠的性行為學(xué)特征

2.2.3行為學(xué)參數(shù)間的相關(guān)性 EL和EF之間相關(guān)系數(shù)為-0.704(P<0.001)，提示EL與EF間相關(guān)性強(qiáng)。

3 討 論

WALDINGER教授等[7]提出的“射精分布理論”認(rèn)為普通男性人群中IELT是連續(xù)的，PE男性的IELT是人群IELT生物變異中較小的部分，且后續(xù)的人群調(diào)查[8]及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]均證明了這一理論。目前原發(fā)性PE建模的方式主要基于射精分布理論，通過(guò)雄性大鼠交配實(shí)驗(yàn)，根據(jù)EF將大鼠劃分為不同性行為表型的組別，從而篩選出快速射精的大鼠[10-11]，這類大鼠的性行為表現(xiàn)與PE患者很相似。根據(jù)EF建立原發(fā)性PE大鼠模型的數(shù)據(jù)表明，在快速射精、正常射精以及遲緩射精3組大鼠中EF表現(xiàn)為顯著減小、EL顯著增大，這與早泄患者的IELT比正常人短這一主要特征一致。ML是代表性欲的參數(shù)[12]，在3組大鼠中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與臨床中原發(fā)性PE與性欲不相關(guān)這一特點(diǎn)相吻合[13]。在EL、EF、MF、ML、IL及IR這6個(gè)參數(shù)方面，EL建模方式與EF建模方式得出的結(jié)果相同，但在IF和PEI方面，EL建模方式顯示3組大鼠間有不同程度的差異，而EF建模方式卻未顯示出其差異。 快速射精大鼠的IF比遲緩射精大鼠小，代表快速射精大鼠更少的插入即可射精，這與原發(fā)性早泄患者少量插入即射精類似。PEI為射精后到再插入的時(shí)間間隔，與大鼠的恢復(fù)能力有關(guān)，可以看出快速射精大鼠比遲緩射精大鼠狀態(tài)恢復(fù)得更快。

以上分析可知，根據(jù)EL的建模方式比根據(jù)EF的建模方式能更好地體現(xiàn)出不同類型大鼠的性行為學(xué)差異。另外，以EF為參數(shù)建立原發(fā)性早泄模型無(wú)法排除PEI的影響，且EF還受到第2次及后續(xù)交配過(guò)程中其他參數(shù)的影響，這些都會(huì)增加誤差，但以EL為參數(shù)的建模方式不會(huì)受到上述影響。再者，相較于EF，EL與原發(fā)性PE患者的IELT同為從插入到射精的時(shí)間計(jì)量，關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。最后，EL和EF之間相關(guān)性較強(qiáng)(r=-0.704，P<0.001)，這也進(jìn)一步證明了用EL建模的可行性。以上分析表明，以EL為參數(shù)建立原發(fā)性PE大鼠模型比以EF為參數(shù)的建模方式受到的影響因素更少，與IELT的關(guān)聯(lián)性更高，能更好地表現(xiàn)出不同類型大鼠間性行為學(xué)的差異。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)EF建立原發(fā)性PE大鼠模型的方法存在需要改進(jìn)之處：①在30 min內(nèi)，大鼠的射精次數(shù)最多只能達(dá)到3次(這和其他研究有一定差異[14]。大鼠批次的差異或飼養(yǎng)環(huán)境的不同可能會(huì)導(dǎo)致這種差異)。為了擴(kuò)大大鼠間行為學(xué)的差異，我們將交配時(shí)間增加到1 h。在此期間，大鼠的射精次數(shù)最多能達(dá)到7次。增加交配時(shí)長(zhǎng)，可以擴(kuò)大大鼠間EF的差距，有利于我們找到更穩(wěn)定的快速射精大鼠。②在交配實(shí)驗(yàn)前1周，對(duì)雌雄大鼠進(jìn)行合籠，這樣可以加快雄鼠對(duì)交配行為的學(xué)習(xí)，加速雄鼠性行為的穩(wěn)定。③在行為學(xué)錄像過(guò)程中，采用有夜視功能的影像系統(tǒng)，營(yíng)造出完全黑暗的環(huán)境，能更大程度地減小環(huán)境對(duì)大鼠的影響。④部分大鼠在交配過(guò)程中，未能完成射精，有些大鼠甚至沒(méi)有插入。這部分大鼠很可能還未習(xí)得交配行為。另一方面，這一部分大鼠的EL實(shí)際值無(wú)法得出。故為了減少誤差，我們?cè)诮＿^(guò)程中，對(duì)于未能完成射精的大鼠予以排除。⑤以EF為參數(shù)建模的10%原則[6]，將EF分布兩端10%的大鼠劃分為快速射精和遲緩射精組。由于這一比例較小，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中為了篩選出一定數(shù)量的早泄大鼠，需要消耗更多的資源。所以我們根據(jù)EL呈正態(tài)分布的特征及正態(tài)分布概率區(qū)間，提出以μ-σ和μ+σ為分界，即將EL分布兩端約15.87%的大鼠劃分為快速射精和遲緩射精組。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，這樣的劃分方式可以篩選出符合原發(fā)性PE患者特征的快速射精大鼠，且擴(kuò)大了納入范圍，減少了實(shí)驗(yàn)消耗。

綜上所述，根據(jù)EL建立原發(fā)性PE大鼠模型的方法可行，且在某些方面優(yōu)于以EF為參數(shù)的建模方式。希望這一建模方式能為以后原發(fā)性PE的機(jī)制研究提供幫助。