薛 津，賈微微，白麗娜，牛曉辰，王曉暉，王 麗

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，山西太原 030001)

腎細(xì)胞癌(renal cell cancer, RCC)是發(fā)生在腎臟的腫瘤，其惡性程度較高。腎細(xì)胞癌有5種組織學(xué)分型，腎乳頭狀細(xì)胞癌(papillary renal cell cancer，PRCC)是發(fā)病率第2的分型，約占腎細(xì)胞癌的15%～20%[1]。PRCC的治療方式有傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放化療和分子靶向治療，而分子靶向治療僅有少量方式有顯著效果，比如使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和mTOR抑制劑[2-3]。然而對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，其療效依然非常有限[4-5]。在現(xiàn)有的研究結(jié)果中，PRCC相關(guān)的治療靶點(diǎn)以及預(yù)后標(biāo)志物十分匱乏。因此，尋找新的有關(guān)PRCC患者的治療靶點(diǎn)以及預(yù)后標(biāo)志物對(duì)于臨床而言非常迫切。

腫瘤標(biāo)記物中的lncRNA、miRNA、mRNA以及腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞對(duì)于預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后和腫瘤的治療至關(guān)重要[6-9]。本文我們研究了不同類型的基因，包括lncRNA、miRNA以及mRNA，并且構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)以及能夠預(yù)測(cè)PRCC患者預(yù)后的基因風(fēng)險(xiǎn)模型；同時(shí)我們分析了PRCC相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況，并且構(gòu)建了免疫細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)模型；最后我們將與PRCC患者相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因以及風(fēng)險(xiǎn)免疫細(xì)胞進(jìn)行共表達(dá)分析，找到其中的關(guān)系，從而找到新的PRCC潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 差異基因表達(dá)的數(shù)據(jù)分析從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PRCC患者的臨床信息、RNA和miRNA的測(cè)序數(shù)據(jù)。我們使用R軟件中的“DESeq2”包篩選出在腫瘤樣本和正常樣本中表達(dá)有差異的RNA分子。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2fold change (FC)|>1.0 和P<0.05。P值經(jīng)過(guò)假陽(yáng)性發(fā)生率(false discovery rate, FDR)校正。

1.2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用R軟件中的“GDCRNATools”包構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)過(guò)超幾何檢驗(yàn)和相關(guān)性分析(P<0.05)之后，留下顯著相關(guān)的基因，構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)。ceRNA網(wǎng)絡(luò)用Cytoscape v3.8.2進(jìn)行可視化。

1.3 基因模型的建立及基因的生存分析將ceRNA網(wǎng)絡(luò)中所有基因進(jìn)行單因素Cox分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，保留顯著性基因。為了防止模型的過(guò)度擬合，將保留下來(lái)的基因進(jìn)行l(wèi)asso回歸檢驗(yàn)，并且通過(guò)多因素Cox分析再次進(jìn)行篩選，最后得到基因風(fēng)險(xiǎn)模型，通過(guò)生存曲線和ROC曲線以及列線圖對(duì)基因風(fēng)險(xiǎn)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。利用R軟件中的“survival”包對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的分子進(jìn)行生存分析，P<0.05為此RNA分子與患者的預(yù)后顯著相關(guān)。

1.4 免疫細(xì)胞模型的建立及免疫細(xì)胞的生存分析通過(guò)CIBERSORT算法對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估，去除所有表達(dá)量為0的免疫細(xì)胞，計(jì)算出剩余免疫細(xì)胞在每個(gè)樣本中的相對(duì)含量。將免疫細(xì)胞進(jìn)行單因素Cox分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，保留顯著性免疫細(xì)胞。為了防止模型的過(guò)度擬合，將保留的免疫細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)asso回歸檢驗(yàn)，并且通過(guò)多因素Cox分析再次篩選免疫細(xì)胞，最后得到免疫細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)模型，通過(guò)生存曲線和ROC曲線以及列線圖對(duì)免疫細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。利用R軟件中的“survival”包對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行生存分析，P<0.05時(shí)免疫細(xì)胞與患者的預(yù)后顯著相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)的lncRNA、miRNA和mRNA的鑒定從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中共下載321例原始RNA表達(dá)譜(289例PRCC樣本和32例正常樣本)和326例原始miRNA-sep數(shù)據(jù)(292例PRCC樣本和34例正常樣本)。數(shù)據(jù)中共包含了60 483個(gè)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)以及2 079個(gè)miRNAs數(shù)據(jù)。經(jīng)過(guò)篩選后(FDR<0.05，|log2FC|>1)得到具有差異的306個(gè)lncRNA(259個(gè)上升，47個(gè)下降)、136個(gè)miRNA(59個(gè)上升，77個(gè)下降)以及2 692個(gè)mRNA(1 579個(gè)上升，1 113個(gè)下降)。

2.2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)和基因風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建與分析ceRNA網(wǎng)絡(luò)共由4個(gè)lncRNA、4個(gè)miRNA及49個(gè)mRNA構(gòu)建而成，其中包含5對(duì)lncRNA-miRNA及50對(duì)miRNA-mRNA(圖1)。將ceRNA網(wǎng)絡(luò)中所有的基因進(jìn)行單因素分析、lasso回歸以及多因素分析之后，篩選出11個(gè)基因建立風(fēng)險(xiǎn)模型，分別是ELN、COL1A1、EFEMP1、SYNGR3、DBT、KCTD15、RNF149、IKBIP、ATAD5、TCF4和hsa-miR-133a-3p，以評(píng)估患者的預(yù)后，生存曲線和ROC曲線都說(shuō)明了風(fēng)險(xiǎn)模型的準(zhǔn)確性(1年生存率ROC曲線下面積為0.956、3年生存率ROC曲線面積為0.865、5年生存率ROC曲線面積為0.8，圖2A～C)。對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)COL1A1與患者生存呈負(fù)相關(guān)(P=0.002，圖2D)。

圖1 ceRNA網(wǎng)絡(luò)(包含4個(gè)lncRNA、4個(gè)miRNA及49個(gè)mRNA)

A、B：基因風(fēng)險(xiǎn)模型生存曲線和ROC曲線；C：多因素Cox回歸分析結(jié)果；D：COL1A1與患者生存呈負(fù)相關(guān)。圖2 基因風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建以及單個(gè)基因生存分析

2.3 PRCC相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)以及免疫細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建和分析通過(guò)CIBERSORT算法評(píng)估出PRCC患者主要的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)類型。通過(guò)免疫細(xì)胞熱圖和差異分析我們發(fā)現(xiàn)原始B細(xì)胞(P=0.004)、原始CD4+T細(xì)胞(P=0.008)、靜止CD4+記憶T細(xì)胞(P=0.002)、γδ-T細(xì)胞(P=0.007)、單核細(xì)胞(P=0.012)、巨噬細(xì)胞M0(Macrophages M0)(P=0.034)和巨噬細(xì)胞M2(P=0.005)在腫瘤樣本和正常樣本中有顯著差異，并且巨噬細(xì)胞M0和巨噬細(xì)胞M2在腫瘤樣本中明顯增高。將評(píng)估出的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)類型進(jìn)行單因素分析、lasso回歸以及多因素分析之后，僅篩選出2種免疫細(xì)胞構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，分別為巨噬細(xì)胞M0和活化的CD4+記憶T細(xì)胞(T cells CD4 memory activated)，以評(píng)估患者預(yù)后，生存曲線和ROC曲線都說(shuō)明了風(fēng)險(xiǎn)模型的準(zhǔn)確性(1年生存率ROC曲線面積0.911，3年生存率ROC曲線面積0.845，5年生存率ROC曲線面積0.841)(圖3A、B、D)。對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M0同患者生存呈正相關(guān)(P=0.005)，活化的CD4+記憶T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(P<0.001,圖3C、E)。

A、B：免疫細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)模型生存曲線和ROC曲線；C：巨噬細(xì)胞M0同患者生存呈正相關(guān)；D：多因素Cox回歸分析結(jié)果；E：活化的CD4+記憶T細(xì)胞同患者生存呈負(fù)相關(guān)。圖3 免疫細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建以及單個(gè)免疫細(xì)胞生存分析

2.4 ceRNA網(wǎng)絡(luò)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)共表達(dá)分析同時(shí)我們還做了風(fēng)險(xiǎn)模型中基因和免疫細(xì)胞的共表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)DBT與巨噬細(xì)胞M0、TCF4與活化的CD4+記憶T細(xì)胞呈正相關(guān)(圖4)?？梢酝茰y(cè)，基因DBT、TCF4和免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞M0、活化的CD4+記憶T細(xì)胞可能是PRCC患者治療的新靶點(diǎn)并且能有效預(yù)測(cè)PRCC患者的預(yù)后。

A：免疫細(xì)胞之間的共表達(dá)圖；C：免疫細(xì)胞與基因之間的共表達(dá)圖；B、D：DBT與巨噬細(xì)胞M0、TCF4與活化的CD4+記憶T細(xì)胞呈正相關(guān)。圖4 基因與免疫細(xì)胞共表達(dá)分析

3 討 論

PRCC是一種高度異質(zhì)性的疾病，具有不同的形態(tài)特征和生物學(xué)行為[10]。腫瘤標(biāo)記物和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)于腫瘤的診斷與治療十分重要，但是大部分研究都聚焦在ccRCC，對(duì)于PRCC研究甚少。因此我們綜合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因數(shù)據(jù)以及PRCC患者免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行研究，進(jìn)一步探究其新的潛在治療靶點(diǎn)以及預(yù)后標(biāo)志物。

我們構(gòu)建了PRCC相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)、基因風(fēng)險(xiǎn)模型和免疫細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)模型。兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)模型共包含11個(gè)基因和2種免疫細(xì)胞，分別是ELN、COL1A1、EFEMP1、SYNGR3、DBT、KCTD15、RNF149、IKBIP、ATAD5、TCF4和hsa-miR-133a-3p，以及巨噬細(xì)胞M0和活化的CD4+記憶T細(xì)胞。以上基因以及免疫細(xì)胞和PRCC患者的預(yù)后相關(guān)，通過(guò)這兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)模型可以很好地預(yù)測(cè)PRCC患者的預(yù)后。我們還發(fā)現(xiàn)DBT與巨噬細(xì)胞M0、TCF4與活化的CD4+記憶T細(xì)胞呈正相關(guān)，可以推測(cè)這兩對(duì)基因與免疫細(xì)胞以及他們的作用機(jī)制對(duì)PRCC患者的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和治療有意義。

巨噬細(xì)胞在腫瘤中是一把雙刃劍，具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展以及抗腫瘤作用，在腫瘤中具體發(fā)揮哪種作用則取決于腫瘤微環(huán)境中一系列信號(hào)因子的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞因子和趨化因子等[11]。在巨噬細(xì)胞中，M0為未激活亞型，不表現(xiàn)出炎癥或腫瘤相關(guān)功能，而M0可以分化為M1和M2兩種激活亞型，M1和M2具有直接的免疫調(diào)節(jié)作用[12-14]。免疫細(xì)胞熱圖和差異分析結(jié)果表明，M2在PRCC腫瘤組織中明顯增高。有研究表明人類PRCC細(xì)胞分泌IL-8、CXCL16等趨化因子，并且這些因子可以在體外吸引原代人單核細(xì)胞，長(zhǎng)期培養(yǎng)之后轉(zhuǎn)化為典型的M2型泡沫狀巨噬細(xì)胞[15]，這可能是M2在PRCC腫瘤組織中增高的原因。在PRCC患者中，M1與患者的生存呈正相關(guān)，并且可以抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，具有抗腫瘤作用[16-18]。我們的研究發(fā)現(xiàn)M0與PRCC患者的生存呈正相關(guān)，可以推測(cè)M0通過(guò)分化為M1進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。共表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)DBT與M0呈正相關(guān)，可以通過(guò)增強(qiáng)DBT來(lái)間接提高患者的生存率。由于有關(guān)DBT與M0之間的研究較少，所以具體的機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

CD4+T細(xì)胞是體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)細(xì)胞，對(duì)于B細(xì)胞進(jìn)行同型轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生高親和力抗體以及巨噬細(xì)胞的殺傷作用都有至關(guān)重要的作用，其中CD4+記憶T細(xì)胞可能在保護(hù)性免疫反應(yīng)的維持和控制中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在ccRCC中，高風(fēng)險(xiǎn)患者組活化的CD4+記憶T細(xì)胞升高[20]，在結(jié)直腸癌中，活化的CD4+記憶T細(xì)胞在腫瘤組織中明顯增高，并且在T1～2期中含量高于T3～4期[21]。這些結(jié)果提示活化的CD4+記憶T細(xì)胞與患者的風(fēng)險(xiǎn)度相關(guān)。我們的研究同樣說(shuō)明了這一點(diǎn)：活化的CD4+記憶T細(xì)胞與PRCC患者的生存呈負(fù)相關(guān)。共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，TCF4與活化的CD4+記憶T細(xì)胞呈正相關(guān)，TCF4功能增強(qiáng)可以誘導(dǎo)Wnt靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[22]，這可能是PRCC患者高風(fēng)險(xiǎn)的原因之一，抑制TCF4的功能可能會(huì)有利于患者預(yù)后。Wnt通路與TCF4以及T細(xì)胞的分化激活都密切相關(guān)[23-24]，這可能與二者在PRCC中的聯(lián)系有關(guān)，還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

另外，有研究發(fā)現(xiàn)，ELN與PRCC患者的預(yù)后相關(guān)[25]，這可能是因?yàn)镋LN編碼彈性蛋白，而這種蛋白是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵蛋白[26]，這與我們的結(jié)論相一致；另有研究表明，DUXAP8和DUXAP9表達(dá)與PRCC患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，而COL1A1被鑒定為DUXAP8和DUXAP9的功能靶基因[27]，我們的結(jié)果顯示COL1A1與PRCC患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，因此可以推斷DUXAP8和DUXAP9對(duì)PRCC患者的影響可能是通過(guò)COL1A1進(jìn)行的。

這些基因和免疫細(xì)胞在其他腫瘤研究中也有著重要作用，例如hsa-miR-133a-3p在口腔癌[28]、腸癌[29]以及非小細(xì)胞肺癌[30]中都是重要的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，在RS4;11細(xì)胞系中下調(diào)KCTD15基因后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和死亡，提示該蛋白在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和增殖中發(fā)揮作用[31]；結(jié)直腸癌以及ccRCC的腫瘤組織中M0含量均增高[21，32]，并且在ccRCC中，M0與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)[32]。這些基因與免疫細(xì)胞的研究顯示出了巨大的潛力，不僅對(duì)PRCC患者有重要意義，同時(shí)也是其他癌癥診斷的生物標(biāo)志物。

綜上所述，我們構(gòu)建了PRCC相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)以及基因和免疫細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)模型，發(fā)現(xiàn)了PRCC患者新的可能的治療靶點(diǎn)以及預(yù)后標(biāo)志物，共包含11個(gè)重要的基因、2個(gè)重要的免疫細(xì)胞以及2對(duì)基因與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，為PRCC患者的治療提供了新思路。