洪丹， 梁麗住， 郭書萌， 王亮春， 石臻睿

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，表皮的異常增殖分化、真皮炎癥細(xì)胞的浸潤和真皮乳頭毛細(xì)血管的增生、擴(kuò)張是銀屑病的三大病理基礎(chǔ)特征[1]。輔助性T細(xì)胞(T helper cell，Th)17和相關(guān)細(xì)胞因子在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，Th17相關(guān)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17A、IL-17F等能夠刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞的遷移和活化，促進(jìn)毛細(xì)血管的增生，直接影響銀屑病的上述病理改變[2]。臨床上針對(duì)IL-17A及其相關(guān)通路的生物制劑能夠使疾病緩解率達(dá)80%以上，也印證IL-17A通路在銀屑病發(fā)病中的關(guān)鍵作用[3]。

Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor，RUNX)主要包括RUNX1、RUNX2和RUNX3三個(gè)成員。作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞發(fā)育、增殖分化以及凋亡中起著關(guān)鍵作用[4]。近年來，RUNX在免疫中的調(diào)節(jié)作用也被逐漸揭示，比如RUNX1調(diào)節(jié)核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號(hào)通路影響肺部炎癥[5]，RUNX3影響Th1/Th2分化[6]。有文獻(xiàn)表明RUNX1、3是銀屑病的易感基因[7]，還有研究進(jìn)一步顯示RUNX3在銀屑病外周血CD4+T細(xì)胞高表達(dá)[8]，提示RUNX家族分子可能參與銀屑病的發(fā)病。然而，目前尚無關(guān)于RUNX家族在銀屑病皮損中表達(dá)情況及其與局域免疫相關(guān)性的研究。本文通過免疫組化分析RUNX1、2、3在正常人皮膚(healthy control，HC)、慢性濕疹(chronic eczema，CE)、尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris，PV)皮損中的分布和表達(dá)，并利用已發(fā)表的芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析皮膚RUNX豐度與增殖、凋亡、免疫信號(hào)通路的相關(guān)性，以期為RUNX在銀屑病發(fā)病中的作用和機(jī)制提供初步理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例來源

1.1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 經(jīng)Gene Expression Omnibus(GEO)平臺(tái)下載GSE109248微陣列結(jié)果。

1.2 主要試劑、儀器

兔抗人RUNX1、RUNX2抗體(Abcam，英國)，小鼠抗人RUNX3抗體(Abcam，英國)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(中杉金橋，中國)，過氧化物酶封閉液(中杉金橋，中國)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(中杉金橋，中國)，10%福爾馬林固定液(廣州化學(xué)試劑廠，中國)，EDTA抗原修復(fù)液pH8.0(中杉金橋，中國)，蘇木素(中杉金橋，中國)。正置成像顯微鏡(尼康，日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)(IHC)檢測三組皮膚中RUNX1、2、3的表達(dá) 將HC、PV和CE的皮損分別經(jīng)10%福爾馬林固定24 h、石蠟包埋。將石蠟包埋皮膚組織制成4 μm切片，置于60 ℃恒溫干燥箱烘烤至少2 h，依次經(jīng)二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇脫蠟及水化，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。EDTA微波法修復(fù)后，切片分別滴加抗RUNX1抗體(1 ∶200)、抗RUNX2抗體(1 ∶200)、抗RUNX3抗體(1 ∶40)、抗體稀釋液(陰性對(duì)照組)，放置在孵育盒內(nèi)4 ℃冰箱中孵育約12 h，復(fù)溫后于室溫孵育HRP-山羊抗兔(RUNX1、RUNX2組、陰性對(duì)照)、HRP-山羊抗小鼠(RUNX3組、陰性對(duì)照)二抗30 min，經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，常規(guī)脫水、封片。通過顯微鏡獲取圖像，經(jīng)Image-proplus 6.0行灰度轉(zhuǎn)換，通過平均光密度值(mean density，MD)對(duì)表皮染色進(jìn)行半定量分析[9]。

1.3.2 銀屑病皮損中RUNX相關(guān)基因的GO(gene ontology)富集分析 GSE109248數(shù)據(jù)庫中，利用R語言篩選與RUNX1、2、3的mRNA表達(dá)水平分別存在pearson相關(guān)性(P<0.05)的基因，依據(jù)正、負(fù)相關(guān)性分為2個(gè)基因集，通過R包“clusterProfiler”進(jìn)行GO富集分析，包括生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)及繪制氣泡圖，利用R包“ggstatsplot”展示RUNX與重要分子的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 微陣列數(shù)據(jù)中RUNX1、2、3在HC和PV皮損中的mRNA表達(dá)情況

利用從GEO平臺(tái)上獲得GSE109248的微陣列基因表達(dá)數(shù)據(jù)，比較14例HC和17例PV皮損中RUNX的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示，與HC相比，PV皮損中RUNX1呈低表達(dá)、RUNX3高表達(dá)，而RUNX2的水平在兩組皮膚中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。

圖1 微陣列數(shù)據(jù)GSE109248中RUNX1、2、3在健康對(duì)照(HC)和銀屑病(PV)皮損中的mRNA表達(dá)情況Figure 1 The mRNA expression of the RUNX family in skin from healthy controls and psoriasis patients in microarray data GSE109248.

2.2 免疫組化檢測RUNX1、2、3在三組皮損中的蛋白表達(dá)情況

由圖2可見，在健康皮膚中，RUNX1在表皮全層的角質(zhì)形成細(xì)胞、真皮的毛囊和血管內(nèi)皮細(xì)胞、汗腺導(dǎo)管的胞核、胞質(zhì)均有豐富表達(dá)；PV皮損中，RUNX1在表皮的表達(dá)顯著下降，而在真皮浸潤的炎癥細(xì)胞中高表達(dá)；CE也存在表皮RUNX1表達(dá)下降，但與PV皮損不同的是，RUNX1在CE的表皮胞核中仍有較豐富的表達(dá)，提示RUNX1在兩者的表皮細(xì)胞內(nèi)空間分布不同。與RUNX1分布不同，無論是正常皮膚、慢性濕疹還是銀屑病，RUNX2、3主要在真皮浸潤的炎癥細(xì)胞表達(dá)，而在表皮基底層細(xì)胞、真皮的毛囊及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞核中僅散在陽性。通過MD半定量分析表皮中的RUNX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PV與CE表皮中的RUNX1與HC相比均下降，但前兩者之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PV表皮RUNX2較正常表皮和CE升高。RUNX3在三組間無差異。

圖2 免疫組化檢測(100×)RUNX1、2、3在健康對(duì)照(HC)、銀屑病(PV)和慢性濕疹(CE)皮損中的蛋白表達(dá)情況及表皮半定量分析Figure 2 IHC detection (100×) of protein level of RUNX1, 2 and 3 in skin from HC, lesions from PV and chronic eczema and semi-quantitative analysis of epidermis.

2.3 銀屑病皮損中RUNX1與凋亡、增殖標(biāo)志物、Th17相關(guān)分子的相關(guān)性分析

分析GSE109248中銀屑病皮損其他基因的水平與RUNX1的相關(guān)性，得到1 176個(gè)與RUNX1正相關(guān)的基因及1 389個(gè)呈負(fù)相關(guān)的基因。GO富集分析并未得到與銀屑病有密切相關(guān)的通路(數(shù)據(jù)未展示)。鑒于RUNX1在表皮豐富表達(dá)，且與細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)，分析銀屑病皮損中RUNX1與凋亡(BCL2、BAX、CASP3)、增殖和分化相關(guān)基因(AREG、TGFA、TGFB3、MKI67、KRT6、KRT16、KRT17、KRT4、KRT10、FLG、LOR、LCE2/3s、WNT家族)的相關(guān)性(圖3A、3C)，結(jié)果表明RUNX1與抗凋亡蛋白BCL2負(fù)相關(guān)，與WNT2、WNT7B、WNT8A負(fù)相關(guān)，而與WNT9B正相關(guān)。分析RUNX1的水平與T細(xì)胞免疫分子的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RUNX1與Th17相關(guān)細(xì)胞因子(IL-17A、IL-17F、IL-17E)呈負(fù)相關(guān)(圖3B)，而與其它Th1、Th2以及Treg基因無明顯相關(guān)性。

圖3 銀屑病皮損中RUNX1與凋亡(3A)、Th17相關(guān)分子(3B)、增殖標(biāo)志物(3C)的相關(guān)性分析Figure 3 Correlation between RUNX1 and apoptosis(3A), Th17 related markers(3B) and proliferation related markers(3C) in psoriatic lesions.

2.4 銀屑病皮損中RUNX3相關(guān)基因的GO富集分析

利用相同數(shù)據(jù)庫中與RUNX3有相關(guān)性的基因(1 275個(gè)正相關(guān)基因、900個(gè)負(fù)相關(guān)基因)進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RUNX3呈正相關(guān)的基因主要富集在T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的活化和分化等通路(圖4A)，而與RUNX3呈負(fù)相關(guān)的基因集參與負(fù)調(diào)節(jié)WNT通路(圖4B)。進(jìn)一步分析RUNX3與Th1、Th2、Th17/Th22、Treg相關(guān)基因的相關(guān)性(圖4C)，結(jié)果表明，RUNX3與Th1通路(STAT4、CXCR3、TNF)、Th17通路(CCR6、IL22)和Treg通路(TGFB、IL-10)呈正相關(guān)關(guān)系，而與Th2通路基因無相關(guān)性。在凋亡、增殖和分化方面(圖4C)，RUNX3與銀屑病增殖相關(guān)的KRT16呈正相關(guān)，與KRT6B負(fù)相關(guān)。

圖4 銀屑病皮損中RUNX3相關(guān)基因的GO富集分析 4A：與RUNX3正相關(guān)基因的GO富集分析；4B：與RUNX3負(fù)相關(guān)基因的GO富集分析；4C：RUNX3與免疫、增殖、分化標(biāo)志物的相關(guān)性分析Figure 4 GO analysis of genes correlated to RUNX3 in psoriatic lesions. 4A: GO analysis of genes positively correlated with RUNX3; 4B: GO analysis of genes negatively correlated with RUNX3; 4C: correlation analysis of RUNX3 with immune, proliferation, and differentiation markers.

3 討論

RUNX1在多種組織器官上廣泛表達(dá)，細(xì)胞水平上主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)中也有分布。在LPS誘導(dǎo)的肺上皮炎癥中，RUNX1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)能夠拮抗NF-κB信號(hào)通路的活化，說明RUNX1在細(xì)胞內(nèi)的分布與其調(diào)節(jié)炎癥功能相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管RUNX1在慢性濕疹和銀屑病的表皮中均顯著下降，RUNX1在兩者的細(xì)胞亞定位上不同，提示RUNX1在慢性濕疹和銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中發(fā)揮的功能可能有所區(qū)別。此外，RUNX1與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。既往研究表明，DNp63與p53共同參與下調(diào)RUNX1，從而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌都存在RUNX1表達(dá)失調(diào)，前者表現(xiàn)為顯著豐富的表達(dá)，后者表達(dá)相較前者顯著減弱[11]。WNT通路在銀屑病中發(fā)揮重要的致病作用，顯著上調(diào)的WNT5A參與促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[12]和炎癥產(chǎn)生[13]。本研究提示RUNX1的表達(dá)與WNT2、WNT7B、WNT8A呈負(fù)相關(guān)，與WNT9B呈正相關(guān)。據(jù)報(bào)道前兩者在銀屑病皮損中下調(diào)[14]，RUNX1與WNT家族的相互關(guān)系是否參與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化，從而參與銀屑病仍有待進(jìn)一步研究。

RUNX3被認(rèn)為是重要的免疫調(diào)節(jié)因子。體外實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)RUNX3促進(jìn)正常人來源的CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-17、IL-22、IL-6等銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子，而在銀屑病來源的CD4+T細(xì)胞中沉默RUNX3可降低Th17、Th22細(xì)胞比例[8]，提示RUNX3可能通過促進(jìn)Th17參與銀屑病發(fā)病。然而，RUNX3如何調(diào)節(jié)Th17的機(jī)制尚不明確。既往研究提示RUNX可能作為TGF-β的下游[15]或轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控RORγt/AHR[16]，進(jìn)而影響Th17的分化。而本研究發(fā)現(xiàn)RUNX3與 CCR6正相關(guān)。CCR6表達(dá)于Th17細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，介導(dǎo)其向炎癥部位遷移[17]。CCR6在銀屑病發(fā)病中起重要作用，敲除或阻斷CCR6均能顯著改善小鼠銀屑病樣皮炎[18]。因此，推測RUNX3通過CCR6調(diào)控Th17遷移可能是其參與銀屑病發(fā)病的機(jī)制之一。有研究也證實(shí)RUNX3可調(diào)節(jié)趨化因子受體CCR7影響樹突狀細(xì)胞向肺部引流淋巴結(jié)遷徙[19]，說明RUNX3在炎癥細(xì)胞趨化中發(fā)揮作用。下一步將進(jìn)行體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證RUNX3對(duì)T細(xì)胞CCR6表達(dá)及其遷移、IL-17A表達(dá)的影響。

除Th17外，RUNX3也參與Th1、Th2以及Treg的分化或活化。RUNX3能夠分別協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子T-bet促進(jìn)Th1分化[20]、抑制GATA3而抑制Th2分化[21]。在銀屑病的CD4+T細(xì)胞中，低表達(dá)的 miR-138通過上調(diào)RUNX3進(jìn)而提高Th1/Th2比例[6]。RUNX3還是Treg細(xì)胞分化、活化的必要條件，RUNX3敲除小鼠的Treg細(xì)胞失去抑制腸道炎癥和繼發(fā)腫瘤的能力[22]。本研究發(fā)現(xiàn)RUNX3與Treg相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β以及IL-10呈正相關(guān)。TGF-β在Treg及Th17的分化中均起到重要作用。研究表明Th0向Th17分化還是Treg分化主要取決于TGF-β的實(shí)際濃度以及其它同時(shí)存在的細(xì)胞因子[23-24]。本研究并未發(fā)現(xiàn)RUNX3與Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子如FOXP3具備相關(guān)性，因此認(rèn)為在銀屑病皮損中RUNX3與TGF-β的正相關(guān)性更可能與局部Th17活化相關(guān)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)RUNX3與抑炎細(xì)胞因子IL-10呈正相關(guān)。既往研究也發(fā)現(xiàn)IL-10在銀屑病皮損中升高，提示IL-10可能扮演負(fù)性調(diào)控的作用[25]。從轉(zhuǎn)錄角度上，IL-10受到NF-κB、干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)和STAT3等促炎因子相關(guān)啟動(dòng)子的調(diào)控[26]。因此推測RUNX3與IL-10的相關(guān)性也是由于IL-10在炎癥環(huán)境中被負(fù)性調(diào)控升高所致。總之，RUNX3可能通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)不同亞型T細(xì)胞的表型和功能，參與銀屑病的發(fā)病。雖然本研究發(fā)現(xiàn)RUNX3與多種T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子具有相關(guān)性，但RUNX3是否參與銀屑病的發(fā)病以及其對(duì)免疫環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，還有待進(jìn)一步的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

KRT6、16、17不僅被認(rèn)為是銀屑病的重要標(biāo)志分子，且共同參與表皮的增殖、遷移和免疫應(yīng)答[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)RUNX3與KRT16正相關(guān)，與KRT6B呈負(fù)相關(guān)，由于RUNX3在銀屑病皮損中主要表達(dá)于免疫細(xì)胞，因此推測其作為轉(zhuǎn)錄因子，可能參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的炎癥分泌，進(jìn)而影響角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化，其作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示，RUNX1、RUNX2和RUNX3在銀屑病皮損中的細(xì)胞定位和表達(dá)變化各不相同，但銀屑病皮損中RUNX1和RUNX3的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均較健康對(duì)照皮膚出現(xiàn)顯著差異；銀屑病皮損中RUNX1、RUNX3的轉(zhuǎn)錄水平與多種增殖凋亡、T細(xì)胞免疫包括Th1、Th17相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)，但RUNX家族是否影響角質(zhì)形成細(xì)胞和T細(xì)胞表型和功能及其具體機(jī)制，還需深入研究。