周巧玲，王鑫銘，蘇涌，程龍浩，葛朝亮

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230022)

肝硬化是多種慢性肝病的終末期病變。感染是肝硬化患者最常見的嚴(yán)重臨床并發(fā)癥之一，肝硬化伴感染患者病死率較非感染患者提高4倍[1]。研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者感染的發(fā)病機制包括腸道微生物群、腸道通透性、細(xì)菌移位和免疫缺陷等。膽汁酸是在肝臟中由膽固醇合成的內(nèi)源性類固醇分子，對維持機體葡萄糖和脂類的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。法尼醇受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)是膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運的重要調(diào)節(jié)因子；肝損傷時，F(xiàn)XR表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致膽汁酸代謝紊亂[2]。研究表明肝硬化患者伴隨膽汁淤積，易繼發(fā)感染，且具有高病死率。動物實驗表明，膽管結(jié)扎小鼠模型的感染發(fā)生率以及嚴(yán)重程度均顯著上升[3]。巨噬細(xì)胞是機體重要的免疫細(xì)胞之一，作為固有免疫的重要組成部分，是抵御病原體的第一道防線，其通過模式識別受體識別病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，介導(dǎo)免疫效應(yīng)。巨噬細(xì)胞M1型極化可清除機體異物，但是在炎癥免疫反應(yīng)異?？哼M時，巨噬細(xì)胞通過釋放大量的細(xì)胞因子和趨化因子可引發(fā)組織損傷[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者體內(nèi)的鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)、膽酸(cholic acid，CA)、脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)等代謝發(fā)生紊亂，其中CDCA和CA濃度升高，而DCA濃度下降[5]。但代謝異常的膽汁酸對機體炎癥免疫細(xì)胞功能的調(diào)控作用尚未闡明。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的主要組分之一，是感染后細(xì)菌產(chǎn)生毒性反應(yīng)的主要介質(zhì)。LPS作為重要的抗原分子被抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)捕獲，從而引起機體的免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞作為機體重要的APC在LPS的作用下，可顯著活化并發(fā)生M1型極化[6]。本研究選擇肝硬化患者3種主要代謝異常的初級膽汁酸，LPS用于模擬感染時巨噬細(xì)胞所處的微環(huán)境狀態(tài)，通過膽汁酸聯(lián)合LPS刺激巨噬細(xì)胞模擬膽汁淤積伴感染的體外模型，初步探究不同膽汁酸在肝硬化伴感染時對巨噬細(xì)胞功能的影響，以期為臨床肝硬化伴感染患者治療時維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)的重要性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與設(shè)備 SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、Forma3111二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、DMI1倒置顯微鏡(德國Leica公司)、C100細(xì)胞計數(shù)儀(山東博科科學(xué)儀器有限公司)、ELx800酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)、Cytoflex流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)、KDC-1044低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2藥物與試劑 CDCA(美國Sigma公司，貨號：C9377)、CA(美國Sigma公司，貨號：C1129)、DCA(美國Sigma公司，貨號：D2510)、LPS(美國Sigma公司，貨號：L2630)、二甲亞砜(DMSO)(Bioforxx，貨號：EZ6789B121)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(Biosharp公司，貨號：70115000)、Raw264.7細(xì)胞(由實驗室劉加濤老師課題組贈送)、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司，貨號：8120429)、胎牛血清(美國Gibco公司，貨號：10270106)、青霉素-鏈霉素(Biosharp公司，貨號：BL505A)、CCK-8(APE×Bio，貨號：K101815133EF5E)、PE anti-mouse CD163(美國Biolegend公司，貨號：155308)、APC anti-mouse CD86(美國Biolegend公司，貨號：105012)、熒光素標(biāo)記的右旋糖酐(FITC-Dextran，美國Sigma公司，貨號：FD40S)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(無錫耐思)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國costar公司)、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國costar公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 采用含 10% 胎牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Raw264.7 細(xì)胞，在 37 ℃，5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至約80%傳代。

1.4膽汁酸與LPS配制 分別精密稱取CDCA 15.702 8 mg、CA 16.342 8 mg和DCA 15.702 8 mg，加入DMSO 200 μL溶解，配制成終濃度為200 mmol·L-1的母液，分裝于200 μL離心管，-20 ℃凍存。使用時用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。精密稱取LPS 3 mg，加入無菌PBS 6 mL溶解，用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，配制成濃度為0.5 mg·mL-1的母液，分裝，置于-20 ℃保存。使用時用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。

1.5CCK-8檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的Raw264.7細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以每孔2×104接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液50 μL。將96孔板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h，向孔中加入不同濃度的膽汁酸(25，50，100，150，200，400 μmol·L-1)50 μL，加入等體積培養(yǎng)基作為對照組，放入培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)4，6和8 h。加入不同濃度的LPS(12.5，25，50，100，200，400，800，1000 ng·mL-1)50 μL，加入等體積培養(yǎng)基作為對照組，放入培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2，4和6 h，每個濃度梯度設(shè)置6個平行復(fù)孔，向每孔中加入CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～4 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度(A值)，用A值反映細(xì)胞活力。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞極化 根據(jù)CCK-8結(jié)果確定膽汁酸和LPS刺激的濃度和時間，分成5組(對照組、DMSO組、LPS組、膽汁酸組、膽汁酸聯(lián)合LPS組)處理細(xì)胞。將培養(yǎng)箱中24孔板取出，收集巨噬細(xì)胞1×106個，200×g離心5 min，棄上清液，加入含5%BSA的PBS重懸細(xì)胞，200×g離心5 min，棄上清液，加入PBS重懸，向?qū)嶒灲M中各加入APC anti-mouse CD86和PE anti-mouse CD163抗體，使CD86和CD163的終濃度分別為1.3和4 μg·mL-1，4 ℃避光孵育30～45 min，加入PBS，200×g離心5 min，重復(fù)兩次，每管加入PBS 200 μL，流式細(xì)胞儀上機檢測分析。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞吞噬功能 將Raw264.7細(xì)胞以每孔1×105接種于24孔板，按照上述實驗分組處理細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，200×g離心5 min，棄上清液，每個離心管中加入無血清培養(yǎng)基稀釋的FITC-Dextran 300 μL，同時設(shè)置加入無血清培養(yǎng)基的空白對照組和FITC-Dextran 4 ℃的對照，混勻后將離心管分別放在37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中和4 ℃冰箱中靜置90 min，加入PBS，200×g離心5 min，棄上清液，重復(fù)3次，加入PBS200 μL重懸，流式細(xì)胞儀上機檢測分析。

2 結(jié)果

2.1LPS對Raw264.7細(xì)胞活力影響 結(jié)果見圖1。與對照組比較，12.5～50 ng·mL-1LPS刺激Raw264.7細(xì)胞2 h，對細(xì)胞活力沒有影響，100～1000 ng·mL-1LPS處理細(xì)胞后，顯著上調(diào)細(xì)胞活力。與50 ng·mL-1組比較，100 ng·mL-1LPS處理后細(xì)胞活力顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。刺激4和6 h時，25～800 ng·mL-1的LPS處理的細(xì)胞活力均升高。100 ng·mL-1LPS在不同的時間點刺激細(xì)胞，結(jié)果顯示與刺激2 h比較，刺激4 h細(xì)胞活力顯著升高。

2.2CDCA對Raw264.7細(xì)胞活力影響 結(jié)果見圖2。與DMSO組比較，不同濃度CDCA處理Raw264.7細(xì)胞4 h時，細(xì)胞活力未發(fā)生變化。100～400 μmol·L-1CDCA 處理細(xì)胞6 h后，細(xì)胞的活力顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，150 μmol·L-1比100 μmol·L-1CDCA處理組細(xì)胞活力下降更為顯著。處理8 h時，150～400 μmol·L-1CDCA均可下調(diào)細(xì)胞的活力。

2.3CA對Raw264.7細(xì)胞活力影響 結(jié)果見圖3。與對照組比較，DMSO處理組細(xì)胞活力未發(fā)生顯著改變，用不同濃度CA處理Raw264.7細(xì)胞，4 h時，與DMSO組比較，CA濃度為100和200 μmol·L-1時細(xì)胞的活力顯著升高，100與50 μmol·L-1CA組比較細(xì)胞活力顯著升高。處理6 h時，50～200 μmol·L-1的CA處理組的細(xì)胞活力均升高；處理8 h時，50～200 μmol·L-1CA組與DMSO組比較細(xì)胞活力均升高。

①與對照組比較，t=4.63～15.46，P<0.05；②與LPS 50 ng·mL-1組比較，t=3.32～13.08，P<0.05；③與2 h組比較，t=4.61～6.07，P<0.05。

①與DMSO組比較，t=5.83， P <0.05；②與DMSO組比較，t=10.18～13.15，P<0.01；③與CDCA 100 μmol·L-1組比較，t=5.96～10.56，P<0.01。

2.4DCA對Raw264.7細(xì)胞活力影響 實驗結(jié)果見圖4。用不同濃度的DCA處理Raw264.7細(xì)胞4 h時，與DMSO組比較，200，400 μmol·L-1DCA刺激后細(xì)胞活力顯著下降，與150 μmol·L-1組比較，200 μmol·L-1DCA組細(xì)胞活力顯著下降；作用6 h時，150～400 μmol·L-1DCA處理后細(xì)胞活力顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；作用8 h時，50～400 μmol·L-1DCA處理后均下調(diào)細(xì)胞活力。

2.5膽汁酸聯(lián)合LPS對Raw264.7細(xì)胞活力影響 根據(jù)上述實驗結(jié)果，選擇100 ng·mL-1LPS刺激細(xì)胞4 h，用于模擬體外感染。同時分別選擇100 μmol·L-1CDCA刺激細(xì)胞6 h；100 μmol·L-1CA和200 μmol·L-1DCA分別處理細(xì)胞4 h。進一步檢測LPS與膽汁酸聯(lián)合處理Raw264.7細(xì)胞，對細(xì)胞活力的影響。由圖5可知，先用CDCA處理Raw264.7細(xì)胞2 h，加入LPS共同培養(yǎng)4 h，模擬膽汁酸淤積的體外模型，與對照組比較，DMSO組細(xì)胞活力沒有變化，LPS組細(xì)胞活力顯著增加，與DMSO組比較，經(jīng)100 μmol·L-1CDCA刺激的細(xì)胞活力下降；與CDCA組和LPS組比較，CDCA和LPS聯(lián)合刺激的細(xì)胞活力下降。100 μmol·L-1CA和200 μmol·L-1DCA分別與LPS共同孵育4 h，與對照組比較，DMSO組細(xì)胞活力未發(fā)生顯著變化，LPS處理后細(xì)胞活力顯著上升；與DMSO組比較，CA組細(xì)胞活力上升，DCA處理后細(xì)胞活力下降；與CA和LPS組比較，CA與LPS聯(lián)合處理后增加細(xì)胞活力；與DCA組和LPS組比較，DCA與LPS聯(lián)合作用顯著下調(diào)細(xì)胞活力。

①與DMSO組比較，t=3.59，3.77，P<0.05；②與DMSO組比較，t=5.56～11.31，P<0.01；③與CA 50 μmol·L-1組比較，t=6.10～8.21，P<0.01。

①與DMSO組比較，t=5.70～6.52，P<0.05；②與DCA 150 μmol·L-1組比較，t=3.96，3.97，P<0.05；③與DMSO組比較，t=6.28～16.05，P<0.01；④與DCA 150 μmol·L-1組比較，t=7.86，16.44，P<0.01。

2.6細(xì)胞的表型變化 為了進一步研究膽汁酸單獨或聯(lián)合LPS處理對Raw264.7細(xì)胞功能的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測膽汁酸和LPS刺激的巨噬細(xì)胞的表型變化，結(jié)果見圖6。與對照組比較，單獨用膽汁酸刺激細(xì)胞的表型未發(fā)生變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。LPS處理后細(xì)胞發(fā)生M1型極化。膽汁酸與LPS聯(lián)合作用與膽汁酸單獨刺激相比，CDCA和DCA聯(lián)合LPS可促進Raw264.7細(xì)胞發(fā)生M1型極化，CDCA和DCA聯(lián)合LPS刺激與LPS或膽汁酸單獨刺激相比可顯著提高M1型極化標(biāo)志物CD86的水平以及M1/M2比值。CA聯(lián)合LPS對巨噬細(xì)胞極化影響不明顯。

2.7Raw264.7細(xì)胞的吞噬功能 為了進一步研究膽汁酸單獨或聯(lián)合LPS處理對Raw264.7細(xì)胞吞噬功能的影響，用流式細(xì)胞術(shù)檢測膽汁酸單獨或聯(lián)合LPS處理后Raw264.7細(xì)胞對FITC-Dextran的吞噬情況，結(jié)果見圖7。與對照組比較，單獨用CDCA和CA刺激細(xì)胞對細(xì)胞吞噬功能沒有顯著影響，而單獨用DCA刺激的細(xì)胞的吞噬能力下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，LPS處理后細(xì)胞吞噬能力增強。與LPS和相應(yīng)的膽汁酸處理組相比，CDCA和DCA聯(lián)合LPS處理顯著下調(diào)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，與CA組比較，CA與LPS聯(lián)合作用使細(xì)胞吞噬能力增強。

3 討論

免疫系統(tǒng)防御病原體，并維持有機體生命的組織穩(wěn)態(tài)，主要由常駐和招募的巨噬細(xì)胞參與。CD163是一種在巨噬細(xì)胞上特異性表達(dá)的清道夫受體，表達(dá)上調(diào)是巨噬細(xì)胞在炎癥中向其活化表型M2型轉(zhuǎn)變和清除入侵病原體的標(biāo)志。巨噬細(xì)胞作為專職APC，通過表達(dá)CD80/CD86共刺激分子誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生共刺激信號。CD86是M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物之一，CD86表達(dá)上調(diào)提示巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型極化，M1型巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子分泌顯著增多，增加巨噬細(xì)胞吞噬功能，清除微生物[7]。膽汁酸代謝與免疫調(diào)控之間的關(guān)系也被廣泛研究，F(xiàn)XR和G蛋白偶聯(lián)受體(TGR5)是膽汁酸重要的受體，F(xiàn)XR和TGR5位于宿主免疫系統(tǒng)中，在固有免疫細(xì)胞中表達(dá)。膽汁酸作用于巨噬細(xì)胞中的FXR和TGR5，參與免疫細(xì)胞功能調(diào)控，有助于維持機體穩(wěn)態(tài)[2]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者體內(nèi)的膽汁酸代謝譜發(fā)生改變，本研究通過體外模擬膽汁淤積對巨噬細(xì)胞的影響，選擇LPS共同孵育模擬膽汁酸淤積伴感染的環(huán)境，以期闡明疾病狀態(tài)下異常代謝的膽汁酸對巨噬細(xì)胞功能的影響。以此評價代謝異常膽汁酸在肝硬化伴感染過程中的重要作用。

實驗結(jié)果顯示，單獨用LPS刺激Raw264.7細(xì)胞時，100 ng·mL-1LPS在刺激細(xì)胞4 h時，細(xì)胞活力顯著增加，且細(xì)胞發(fā)生M1型極化，同時細(xì)胞的吞噬能力增加。單獨用膽汁酸處理細(xì)胞時，100 μmol·L-1CDCA刺激細(xì)胞6 h后，可下調(diào)細(xì)胞的活力，對細(xì)胞的吞噬功能和表型沒有影響。100 μmol·L-1CA在處理細(xì)胞4 h后可上調(diào)細(xì)胞活力，對細(xì)胞的表型和吞噬功能均無影響。200 μmol·L-1DCA刺激細(xì)胞4 h時，細(xì)胞活力下降，對細(xì)胞的表型無影響，但可下調(diào)細(xì)胞的吞噬能力。病理濃度的CA處理Raw264.7細(xì)胞對細(xì)胞因子的分泌沒有影響，而CDCA和DCA可直接激活巨噬細(xì)胞的NLRP3炎癥小體，發(fā)揮促炎作用[8]。FXR和TGR5受體均為膽汁酸受體，通過與膽汁酸相互作用激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路。不同類型的膽汁酸對巨噬細(xì)胞中的FXR和TGR5的親和力不同，其中對FXR受體親和力的順序：CDCA>DCA>CA，對TGR5激活能力順序：DCA>CDCA>CA，膽汁酸激活TGR5和FXR受體后，可抑制免疫細(xì)胞功能，如抑制其吞噬和分泌細(xì)胞因子的能力。而在感染狀態(tài)下，LPS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞FXR表達(dá)下調(diào)，膽汁酸無法與FXR結(jié)合發(fā)揮抑炎作用，從而促進了巨噬細(xì)胞活化；另一方面，膽汁酸可通過與TGR5結(jié)合，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中ROS生成，促進其向M1型轉(zhuǎn)化[8-9]。因此不同類型的膽汁酸對巨噬細(xì)胞的影響可能依賴于FXR、TGR5的表達(dá)平衡。由此推測，膽汁酸對二者影響不同，可能是本實驗中CDCA、 DCA、CA對巨噬細(xì)胞活力不同影響的原因。

①與DMSO組比較，t=4.32～14.84，P<0.01；②與對照組比較，t=5.54～9.23，P<0.01；③與膽汁酸組比較，t=4.01～15.42，P<0.01；④與LPS 100 ng·mL-1組比較，t=2.96～37.18，P<0.01。

①與對照組比較，t=2.44，P<0.05；②與對照組比較，t=4.23，10.17，P<0.01；③與膽汁酸組比較，t=3.35～16.12，P<0.01；④與LPS 100 ng·mL-1組比較，t=1.86，P<0.05；⑤與LPS 100 ng·mL-1組比較，t=4.35～7.58，P<0.01。

①與對照組比較，t=2.21，P<0.05；②與對照組比較，t=6.69，P<0.01；③與膽汁酸組比較，t=5.23，2.43，P<0.05；④與膽汁酸組比較，t=3.01，P<0.01⑤與LPS 100 ng·mL-1，t=11.53，11.33，P<0.01。

巨噬細(xì)胞具有可塑性，根據(jù)局部微環(huán)境調(diào)整其表型，這使得它在損傷的進展和消退過程中發(fā)揮多種甚至相反的功能。在肝硬化狀態(tài)下，M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，進而加重炎癥反應(yīng)，同時產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，加重肝損傷的嚴(yán)重程度；M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎和組織修復(fù)的調(diào)節(jié)機制，分泌大量促纖維化因子和轉(zhuǎn)化生長因子，促進肝臟纖維化進程，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對肝硬化的進展具有重要的作用[10]。本研究中CDCA和DCA聯(lián)合LPS處理的巨噬細(xì)胞向M1型極化，這可能與在LPS的作用下，F(xiàn)XR的表達(dá)下調(diào)，促進Ca2+內(nèi)流，激活NLRP3炎癥小體，釋放白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)有關(guān)[8]。

有研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組比較，肝硬化患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬能力受損，這與肝病嚴(yán)重程度、隨后的感染發(fā)展和死亡率呈正相關(guān)[11]。吞噬和殺死病原體的能力被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞的主要功能。肝硬化時，巨噬細(xì)胞上Fc和清道夫受體(如CD163)表達(dá)下調(diào)，用于識別和清除外來病原體的模式識別受體(PRRs)表達(dá)受損，使巨噬細(xì)胞無法有效清除凋亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片和免疫復(fù)合物等[12-13]。本研究結(jié)果顯示，CDCA、DCA與LPS聯(lián)合作用下調(diào)Raw264.7細(xì)胞的吞噬能力，這可能與兩者聯(lián)合作用使細(xì)胞活力下降有關(guān)。此外文獻(xiàn)顯示CDCA和DCA可使巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞器發(fā)生改變，同時產(chǎn)生的超氧化物減少，從而降低細(xì)胞的胞飲作用和清除細(xì)菌的能力[14]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在LPS誘導(dǎo)的體外細(xì)胞模型中，3種膽汁酸對細(xì)胞活力、極化以及吞噬能力均存在明顯改變，提示在病理狀態(tài)下，膽汁酸參與調(diào)控巨噬細(xì)胞活力、極化以及吞噬功能。實驗表明膽汁酸可能是肝硬化伴感染的潛在治療靶點，在后期的研究中，仍需要進一步通過體內(nèi)實驗闡明維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)對肝硬化并發(fā)感染的臨床治療價值。