陳岷，張遠(yuǎn)，邊原，鐘磊，陳璐，涂碎萍，李獲

(1.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610072；2.成都市溫江區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部，成都 611130)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一[1]。在2019年全國腫瘤登記中心頒布的2015年中國惡性腫瘤流行情況的數(shù)據(jù)中，我國CRC發(fā)病38.81萬例，位居第3位，死亡為18.704萬例，位居第5位[2]，并且呈逐年增加的趨勢[3]。早期CRC確診率較低，而確診的中晚期CRC患者多已失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，臨床上常采用全身化療[4]。氟尿嘧啶(flurouracil，5-FU)廣泛用于CRC等實(shí)體腫瘤的治療[5]。NCCN臨床實(shí)踐指南結(jié)腸癌(2021.V1)[6]與中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)結(jié)直腸癌診療指南2020版[7]均推薦5-FU為治療CRC的一線化療藥物[8-9]。不同患者5-FU療效與毒性反應(yīng)存在較大差異，甚至有少部分患者出現(xiàn)致死性骨髓抑制等毒性反應(yīng)[10-11]。5-FU臨床一般以體表面積計(jì)算患者用藥劑量，本身無抗腫瘤作用[12-13]，靜脈持續(xù)泵入體內(nèi)后，約80%以上藥物經(jīng)肝臟DPD酶分解代謝為無活性的產(chǎn)物，僅約20%通過尿苷單磷酸合成酶(uridine monophosphate synthetase，UMPS)磷酸化為一磷酸氟尿嘧啶(FUMP)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成三磷酸氟尿嘧啶(FUTP)或三磷酸氟尿嘧啶脫氧核苷(FdUTP)等活性代謝產(chǎn)物，作用RNA和DNA的合成。UMPS基因多態(tài)性與5-FU敏感性密切相關(guān)。國內(nèi)關(guān)于兩者的相關(guān)性研究筆者尚未見到，因此從藥物反應(yīng)遺傳學(xué)角度上分析中國人群CRC患者的UMPS基因多態(tài)性與化療療效和毒性之間的關(guān)系，進(jìn)而加強(qiáng)患者藥學(xué)監(jiān)護(hù)和指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 2017年3月試驗(yàn)計(jì)劃經(jīng)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，編號(hào)：倫審(研)2017年第117號(hào)。納入2017年3月—2018年3月在四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腫瘤科接受mFOLFOX6方案治療、符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的患者70例，入組患者詳細(xì)了解本研究內(nèi)容且皆自愿簽署知情同意書。收集化療前、化療后檢測肝腎功能﹑血常規(guī)，以評(píng)價(jià)毒性反應(yīng)及耐受性，3～4周期MRI、CT、B超等影像學(xué)檢查資料，以評(píng)價(jià)患者療效。記錄患者性別、年齡、組織類型等基礎(chǔ)信息。于6：00—7：00采集患者5-FU泵注24～36 h后的外周EDTA抗凝靜脈血4 mL。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌；②美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評(píng)分 ≤ 2分，預(yù)計(jì)生存期 ≥ 3個(gè)月；③輔助化療停止時(shí)間≥6個(gè)月或未進(jìn)行過化療；④接受mFolfox6方案的化療；⑤肝腎功能﹑血常規(guī)均達(dá)到化療標(biāo)準(zhǔn)；⑥年齡30～75歲；⑦至少有1個(gè)可測量的實(shí)體腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神疾??；②具有嚴(yán)重肝腎疾病；③孕婦；④合并其他抗腫瘤治療；⑤不耐受化療的患者。

1.3化療方案 mFolfox6方案化療：第1 天靜脈滴注奧沙利鉑85 mg·(m2)-1(>2 h)，靜脈滴注亞葉酸鈣400 mg·(m2)-1(>2 h)；滴注結(jié)束后，靜脈推注5-FU 400 mg·(m2)-1，隨后持續(xù)靜脈泵注5-FU 1200 mg·(m2)-1·d-1× 2 d[46～48 h內(nèi)總輸注量2400 mg·(m2)-1]，2周為1個(gè)周期，患者在化療3或4個(gè)周期后評(píng)價(jià)療效。

1.4試驗(yàn)測定和臨床觀察指標(biāo) ①化療治療前后的基礎(chǔ)信息、肝腎功、血常規(guī)、MRI和CT等檢查報(bào)告；②化療后的完全緩解(complete response，CR)、部分緩解率(partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)、客觀有效率(response rate，RR)、疾病進(jìn)展率(progressive disease，PD)和疾病控制率(disease control rate，DCR)；③化療后的骨髓抑制、惡心嘔吐、腹瀉、過敏、手足綜合征等毒性反應(yīng)程度和發(fā)生率。

1.5基因測定方法 DPYD基因分型采用Sanger測序法分析，引物序列rs1801019-F：CAGGGAGGCAAGG-ACAAGTT和rs1801019-R：AGCATCTGCTAGCTGCAA-CA。PCR擴(kuò)增體系共30 μL，包括DNA模版1 μL、正反引物2 μL、PCR擴(kuò)增緩沖液(含Mg2+、dNTP、Taq酶)15 μL，以及12 μL dH2O。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃擴(kuò)增10 s，55 ℃退火保持15 s，72 ℃再延伸10 s，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

1.6療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 患者在接受mFolfox6化療前均接受影像學(xué)檢查，評(píng)估病情，3或4個(gè)周期后重新評(píng)估，影像學(xué)檢查均采用RECIST療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[14]。以(CR+PR)計(jì)算患者疾病治療RR，以(CR+PR+SD)計(jì)算患者DCR。

1.7毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)于患者化療過程中出現(xiàn)的毒性反應(yīng)采用NCI-CTC4.0毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[15]進(jìn)行處理。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 9.2版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，患者基礎(chǔ)信息與療效、毒性反應(yīng)分析采用方差分析和χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1UMPS基因測序結(jié)果 結(jié)果見圖1和圖2。峰型圖以4種顏色代表A(綠色)、T(紅色)、G(黑色)、C(藍(lán)色)4種堿基。峰高低代表信號(hào)強(qiáng)弱，峰寬窄表示分離效果，雙峰代表雜合。圖1中高亮部分為單峰，表示是純合子，圖2中高亮部分為雙峰，表示是雜合子。

2.2UMPS基因SNP的檢測結(jié)果 70例晚期CRC患者，有5例血液樣本提取DNA不合格，因此未納入后續(xù)分析。最終檢測到UMPS基因的rs1801019位點(diǎn)CC 0例(0%)，GC 20例(30.80%)，GG 45例(69.20%)，G基因頻率為84.6%，C基因頻率為15.4%。

2.3UMPS基因的遺傳平衡檢驗(yàn) 對(duì)CRC患者的UMPS基因型頻率進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)研究患者的基因型是否具有群體代表性。由表1可知，以100個(gè)健康人為對(duì)照組，檢測UMPS基因rs1801019位點(diǎn)的符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，結(jié)果GG66例(66.0%)，GC30例(30.0%)，CC4例(4.0%)。

2.4UMPS基因多態(tài)性與臨床特征相關(guān)性 UMPS基因的rs1801019位點(diǎn)的SNP(Gvs.C)分布與性別、年齡、手術(shù)、TNM病理分期、原發(fā)病灶部位、轉(zhuǎn)移、組織病理學(xué)類型分類以及腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。具體結(jié)果見表1。

2.5UMPS基因多態(tài)性與毒性反應(yīng)相關(guān)性 結(jié)果見表2。

2.6UMPS多態(tài)性與療效反應(yīng)相關(guān)性 UMPS基因的rs1801019位點(diǎn)野生型患者疾病控制率高于突變型患者，而疾病進(jìn)展率低于突變型患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表3。

2.7UMPS基因多態(tài)性與PR、SD、PD之間相關(guān)性分析 選取用藥第4個(gè)周期，腫瘤分期為4期的患者，共11例，設(shè)因變量為PD為0，SD為1，PR為2，納入自變量為年齡，性別，基因型進(jìn)行無序多分類邏輯回歸進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果未見相關(guān)性，見表4。

3 討論

由于腫瘤個(gè)體化治療日益成熟，預(yù)測化療引起的療效和嚴(yán)重不良反應(yīng)成為腫瘤患者選擇最佳治療方案時(shí)的重要關(guān)注點(diǎn)。多項(xiàng)研究已經(jīng)在涉及氟嘧啶藥效學(xué)的基因中發(fā)現(xiàn)SNPs，NCCN指南甚至建議對(duì)一些DPYD基因進(jìn)行基因分型，以評(píng)估毒性風(fēng)險(xiǎn)[16]。

5-FU本身無抗腫瘤活性，需經(jīng)體內(nèi)的磷酸化酶轉(zhuǎn)化成為其活性代謝產(chǎn)物。UMPS是5-FU活化過程中最重要的磷酸化酶，可將5-FU通過磷酸化轉(zhuǎn)化為5-FU的活性代謝產(chǎn)物，通過抑制RNA和DNA合成產(chǎn)生抗腫瘤作用。在治療過程中，UMPS的突變或異常表達(dá)可能導(dǎo)致5-FU耐藥。因而UMPS酶基因多態(tài)性與5-FU敏感性密切相關(guān)[15]。從藥物反應(yīng)遺傳學(xué)角度上分析CRC患者UMPS的基因多態(tài)性與化療療效和毒性之間的關(guān)系，具有深刻的意義。

圖1 UMPS rs1801019位點(diǎn)GG純合型測序圖譜(正向測序)

圖2 UMPS rs1801019位點(diǎn)GC雜合型測序圖譜(正向測序)

表1 CRC患者UMPS rs1801019位點(diǎn)多態(tài)性與臨床病理關(guān)系

表2 UMPS基因RS1801019位點(diǎn)基因多態(tài)性與毒性反應(yīng)關(guān)系

表3 CRC患者UMPS rs1801019位點(diǎn)基因多態(tài)性與療效反應(yīng)關(guān)系

表4 CRC患者UMPS rs1801019基因多態(tài)性與PR、SD、PD之間的相關(guān)性分析

UMPS rs1801019位點(diǎn)在亞洲人群中突變率高，約為22%(https：//www.snpedia.com/index.php/Rs1801019)，以前較少報(bào)道過此位點(diǎn)基因多態(tài)性與5-FU療效和毒性風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系，且結(jié)果并不一致。研究發(fā)現(xiàn)，UMPS的表達(dá)水平與5-FU的敏感性具有相關(guān)性，通過降低UMPS的表達(dá)，5-FU的敏感性明顯下降[18]。但目前筆者未見中國人群該基因多態(tài)性的研究，因此本研究主要針對(duì)中國人群的UMPS rs1801019位點(diǎn)基因多態(tài)性與5-FU療效和誘導(dǎo)毒性風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系進(jìn)行研究。

本研究顯示，中國人群UMPS基因的rs1801019位點(diǎn)多態(tài)性與性別、年齡、手術(shù)、TNM病理分期、原發(fā)病灶部位、轉(zhuǎn)移、組織病理學(xué)類型分類以及腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9等臨床基礎(chǔ)數(shù)據(jù)均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。rs1801019位點(diǎn)野生型患者疾病控制率高于突變型患者，而疾病進(jìn)展率低于突變型患者，但皆差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs1801019位點(diǎn)野生型和突變型患者骨髓抑制、惡心嘔吐和腹瀉發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明在中國人群中rs1801019無法單一用于5-FU為基礎(chǔ)治療的療效和不良反應(yīng)的指導(dǎo)。強(qiáng)烈建議監(jiān)測其他代謝酶基因多態(tài)性來共同預(yù)測5-FU的療效和毒性。但陰性結(jié)果原因可能與本研究的樣本量有關(guān)，還需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究其真正的因果變異。