張思晨，孫婷婷，趙志敏,，何國(guó)瑞，楊得坡,

(1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣州510006； 2.廣東省現(xiàn)代中藥工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣州510006)

家蠅(MuscadomesticaL.)，為環(huán)裂亞目麗蠅科蠅屬完全變態(tài)昆蟲，一生經(jīng)歷卵、蛹、幼蟲和成蟲四個(gè)階段，其幼蟲和蛹富含油脂、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[1]。家蠅與其他近緣昆蟲的干燥幼蟲和蛹?xì)ず戏Q為五谷蟲。據(jù)《本草求原》等傳統(tǒng)中醫(yī)典籍記載，五谷蟲經(jīng)干燥研磨后，可外用治療臁、癰等感染創(chuàng)面[2]。目前，國(guó)內(nèi)外均有將五谷蟲用于傷口愈合治療的基礎(chǔ)研究和臨床研究，研究對(duì)象涵蓋五谷蟲活蛆[3]、多肽[4]、溶菌酶[5]、脂肪酸[6]等。另外，其他來源的肽如墨西哥黃唇魚肉寡肽[7]、青蛙抗菌肽[8]、大豆蛋白源肽[9]、神經(jīng)肽[10]等活性肽都被證實(shí)具有促進(jìn)傷口愈合的活性。

傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，是恢復(fù)皮膚屏障完整性的關(guān)鍵。愈合過程分為止血、炎癥、增殖和重塑四個(gè)階段，這四個(gè)階段相互重疊、高度協(xié)調(diào)[11]。傷口形成后不久，凝血形成，在血小板迅速聚集的過程中釋放生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)，生長(zhǎng)因子在傷口早期迅速招募炎癥細(xì)胞[12-13]，炎癥細(xì)胞表達(dá)關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子和介質(zhì)，不斷促進(jìn)修復(fù)過程。傷口形成后幾小時(shí)內(nèi)，角質(zhì)形成細(xì)胞開始遷移并增殖以愈合傷口[14]。因此，角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移與增殖、生長(zhǎng)因子等的表達(dá)，對(duì)于促進(jìn)傷口愈合十分重要。鑒于多肽生物活性和安全性高的優(yōu)點(diǎn)，一些多肽類藥物在促傷口愈合方面的研發(fā)成為近年來的熱門領(lǐng)域之一。家蠅蛹與幼蟲相似，含有十分豐富的生物活性肽類物質(zhì)。但家蠅蛹多肽(peptides from housefly pupa，PHP)是否也具有促傷口愈合活性還未見報(bào)道，故本研究以家蠅蛹為對(duì)象，利用酶解法制備PHP并評(píng)價(jià)PHP的促傷口愈合活性，以期為家蠅蛹的高效資源開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

家蠅蛹，廣東盈亨生物科技有限公司提供。堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；鄰苯二甲醛，上海麥克林生化科技有限公司；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT)，武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；小鼠單核巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)，中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)，派普泰克生物科技(蘇州)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒，欣博盛生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

油浴鍋；pH 計(jì)；冷凍干燥機(jī)，德國(guó) Christ 公司；多功能酶標(biāo)儀，德國(guó)BMG公司；UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF 基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(配備 355 nm Nd:YAG 激光器)，德國(guó)Bruker Daltonics公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PHP的酶解法制備及得率計(jì)算

以正己烷為溶劑，采用索氏提取法對(duì)家蠅蛹進(jìn)行脫脂得到脫脂家蠅蛹粉。準(zhǔn)確稱量10 g脫脂家蠅蛹粉于錐形瓶中，按料液比1∶20加入雙蒸水混勻，于4℃冷提10 min，隨后于100℃油浴鍋中加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，冷卻至酶解溫度后，使用NaOH溶液/HCl溶液調(diào)節(jié)至一定pH，立即加入一定量的蛋白酶，酶解一定時(shí)間。酶解結(jié)束后于100℃滅酶活10 min，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移提取液至離心管中，于5 000 r/min離心5 min，取上清液，冷凍干燥，即得PHP。PHP得率按照下式計(jì)算。

R=(m1-m2)/m0×100%

(1)

式中：R為PHP得率；m1為干燥的多肽質(zhì)量，g；m2為加酶量，g；m0為脫脂家蠅蛹粉質(zhì)量，g。

1.2.2 PHP中多肽含量及水解度測(cè)定

采用鄰苯二甲醛(OPA)法測(cè)定多肽含量及水解度。OPA法的原理是在堿性介質(zhì)中OPA能與游離的氨基發(fā)生反應(yīng)生成具有熒光性的異吲哚衍生物，在340 nm處有特征吸收[15]。OPA試劑配制參考Church等[16]的方法。

通過谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定多肽的含量。具體方案為：配制系列梯度質(zhì)量濃度的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.016、0.000 mg/mL)，分別取20 μL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液與150 μL OPA試劑混勻，精確控制反應(yīng)時(shí)間為2 min，在340 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，以去離子水作為對(duì)照，繪制谷胱甘肽質(zhì)量濃度(x)-吸光度(y)標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=1.599x+0.039，R2=0.999 9)；將待測(cè)樣品配成1 mg/mL的溶液，檢測(cè)方法同谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液組，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多肽含量。

通過絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定水解度[15]。具體方案為：準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，取20 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與150 μL OPA試劑混勻，精確控制反應(yīng)時(shí)間為2 min，在340 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，以去離子水作為對(duì)照；將樣品配制成1 mg/mL的溶液，檢測(cè)方法同標(biāo)準(zhǔn)溶液組，按照下列公式計(jì)算水解度。

D=h/htot×100%

(2)

h=[(A2-A0)/(A1-A0) ×0.951 6×1-β]/α

(3)

式中：D為水解度；h為多肽水解過程中裂解的肽鍵數(shù)；htot為總肽鍵數(shù)，取指定值7.6；A2、A1、A0分別為樣品組、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液組、對(duì)照組的吸光度；α、β分別取指定值1.00、0.40。

1.2.3 PHP對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

將HaCaT細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在含有5% CO2及飽和濕度條件的37℃恒溫培養(yǎng)箱里進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2 × 103個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后，實(shí)驗(yàn)組給予200 μg/mL PHP處理，空白對(duì)照組給予同體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)處理，以0.4 ng/mL EGF作為陽性對(duì)照。培養(yǎng)48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)。按照下式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

R1=A1/A0×100%

(4)

式中：R1為細(xì)胞增殖率；A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A0為空白對(duì)照組吸光度。

1.2.4 PHP對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響

采用經(jīng)典劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PHP對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞(細(xì)胞培養(yǎng)方法見1.2.3)，以2 × 105個(gè)/孔的密度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后，棄掉舊培養(yǎng)基，加入含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基饑餓處理12 h。使用10 μL無菌槍頭在細(xì)胞層垂直劃痕，建立體外細(xì)胞創(chuàng)傷模型，用PBS反復(fù)沖洗至劃痕區(qū)域干凈。實(shí)驗(yàn)組給予200 μg/mL PHP處理，空白對(duì)照組給予同體積的PBS處理，以0.4 ng/mL EGF作為陽性對(duì)照。分別于給藥后0、24、48 h于顯微鏡下拍照。利用Image J軟件進(jìn)行指定劃痕區(qū)域愈合面積計(jì)算，按照下式計(jì)算遷移率。

R2=(S0-Sx)/S0×100%

(5)

式中：R2為細(xì)胞遷移率；S0為0 h時(shí)的劃痕面積；Sx為24 h或48 h時(shí)的劃痕面積。

1.2.5 PHP對(duì)RAW264.7細(xì)胞TGF-β1、TNF-α、IL-6表達(dá)的影響

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)方法同HaCaT細(xì)胞(見1.2.3方法)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5.5× 104個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別給與50、100、200 μg/mL的PHP處理，空白對(duì)照組給予同體積PBS處理，以0.4 ng/mL EGF作為陽性對(duì)照。培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)TGF-β1、IL-6、TNF-α含量。

1.2.6 PHP分子質(zhì)量分布分析

將樣品溶于雙蒸水，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的PHP溶液，采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)分子質(zhì)量分布。分析條件：離子源加速電壓1為20.00 kV，加速電壓2為17.85 kV，離子延時(shí)提取140 ns，正離子譜檢測(cè)，質(zhì)量掃描范圍(m/z)為500～4 000、1 000～20 000。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，用GraghPad Prism 7.0.4軟件處理數(shù)據(jù)。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHP制備酶的篩選

按1.2.1方法，采用不同的蛋白酶，在加酶量8 000 U/g、酶解時(shí)間1 h以及不同蛋白酶酶解溫度和pH(具體見表1)條件下制備PHP，比較不同蛋白酶對(duì)PHP得率、多肽含量及水解度的影響，結(jié)果如圖1所示。

表1 不同蛋白酶酶解條件

注：A～J分別表示胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、α-糜蛋白酶。

由圖1A可見，胃蛋白酶酶解制備的PHP得率最高，為(74.71±2.11)%，其次是風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶，PHP得率分別為(72.82±2.38)%、(62.19±1.31)%和(55.59±2.78)%。由圖1B可見，風(fēng)味蛋白酶酶解制備的PHP多肽含量及水解度最高，分別為(32.67±0.42)%和(15.79±0.25)%。另外，中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶及胃蛋白酶也能制備出較高多肽含量及水解度的PHP。綜上，風(fēng)味蛋白酶酶解法是一種能夠制備高得率、高多肽含量及高水解度PHP的方法。

2.2 風(fēng)味蛋白酶酶解制備家蠅蛹多肽(peptide hydrolyzed with flavourzyme from housefly pupa, PHF)工藝優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

采用單因素實(shí)驗(yàn)，考察酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間對(duì)PHF得率及水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。

注：固定條件為pH 7.0、酶解時(shí)間30 min、加酶量8 000 U/g、酶解溫度60℃，優(yōu)化時(shí)改變單一因素條件。

由圖2A可見，酶解溫度從30℃上升到60℃時(shí)，PHF得率及水解度顯著增加，60℃時(shí)PHF得率及水解度分別為(73.27±2.48)%、(7.57±0.20)%，但當(dāng)酶解溫度升高至70℃時(shí)，PHF得率及水解度明顯降低。這可能與酶的活性有關(guān)，反應(yīng)溫度過低會(huì)大大降低體系內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)程度，從而降低蛋白酶與底物的碰撞概率，反應(yīng)溫度過高會(huì)導(dǎo)致蛋白酶全部或部分喪失催化活性[17]。由圖2B可見：當(dāng)加酶量從4 000 U/g增加至8 000 U/g時(shí)，PHF得率及水解度增長(zhǎng)迅速；當(dāng)加酶量從8 000 U/g增加至12 000 U/g時(shí)，PHF得率增長(zhǎng)緩慢，水解度基本不變。由圖2C可見：酶解時(shí)間從1 h延長(zhǎng)至4 h時(shí)，PHF得率從(74.85±2.08)%增加至(79.45±1.77)%，水解度從(11.47±0.37)%增加至(17.04±0.04)%；酶解時(shí)間從4 h延長(zhǎng)至5 h時(shí)，PHF得率不變，水解度增加不足0.5百分點(diǎn)，可見酶解時(shí)間過長(zhǎng)(>4 h)并不能使PHF得率更高。綜上，確定制備PHF的最佳工藝條件為：酶解溫度60℃，加酶量8 000 U/g，酶解時(shí)間4 h。在最佳條件下， PHF得率為(79.45±1.77)%，水解度為(17.04±0.04)%。

2.3 PHP對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

HaCaT細(xì)胞是傷口愈合過程中發(fā)揮重要功能的細(xì)胞，是再上皮化的關(guān)鍵細(xì)胞。不同蛋白酶酶解(酶解條件如表1所示)制備的PHP對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響如圖3所示。

由圖3可見，不同蛋白酶酶解制備的PHP對(duì)HaCaT細(xì)胞均無顯著的毒性作用。與空白對(duì)照組比較，除復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶外，其余8種蛋白酶制備的PHP及EGF均能不同程度地促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖(P<0.05)。其中，酸性蛋白酶酶解制備的PHP促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)，增殖率為(121.85±8.07)%，其次是風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶酶解制備的PHP，HaCaT細(xì)胞增殖率分別為(118.38±2.36)%、(116.96±2.79)%。

注：A～J分別表示胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、α-糜蛋白酶制備的PHP，下同。與空白對(duì)照組比較，*表示P<0.05。

2.4 PHP對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響

不同蛋白酶酶解制備的PHP對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響如圖4所示。

由圖4可見，與空白對(duì)照組比較，風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶酶解制備的PHP及EGF作用于HaCaT細(xì)胞24、48 h時(shí)，細(xì)胞遷移率均具有顯著性的提升(P<0.05),α-糜蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制備的PHP作用于HaCaT細(xì)胞24 h時(shí)，細(xì)胞的遷移率顯著增加(P<0.05)，而中性蛋白酶酶解制備的PHP處理組在24、48 h時(shí)的細(xì)胞遷移率均無顯著變化。其中，PHF促進(jìn)HaCaT細(xì)胞遷移的活性最佳，其作用的HaCaT細(xì)胞在24、48 h的遷移率分別為(50.59±2.68)%和(63.87±2.16)%。此時(shí)，空白對(duì)照組在24、48 h的遷移率分別為(35.93±3.97)%、(46.88±1.81)%。因此，后續(xù)對(duì)PHF進(jìn)一步研究。

注：與空白對(duì)照組比較，*表示P< 0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2.5 PHF對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖與遷移的影響

為了進(jìn)一步探究PHF的促傷口愈合活性，評(píng)估了PHF在不同質(zhì)量濃度(PHF1,50 μg/mL;PHF2,100 μg/mL;PHF3,200 μg/mL)下對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖與遷移的影響，結(jié)果如圖5所示。

注：A、B分別為PHF對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖、遷移的影響；C為PHF對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移影響的定性分析，標(biāo)尺1 000 μm；與空白對(duì)照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

由圖5A可見，與空白對(duì)照組比較，100、200 μg/mL PHF處理組的HaCaT細(xì)胞增殖率均有顯著提升(P<0.05)，分別提升至(108.20±1.62)%和(117.26±1.20)%。由圖5B可見，與空白對(duì)照組比較，PHF在24 h時(shí)以濃度依賴的方式促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的遷移，100、200 μg/mL PHF處理組HaCaT細(xì)胞在48 h時(shí)的遷移率均具有顯著性的提升(P<0.01)，且200 μg/mL PHF促HaCaT細(xì)胞遷移活性優(yōu)于陽性對(duì)照組。由圖5C可見，給藥之后，HaCaT細(xì)胞逐步遷移至劃痕部位，48 h時(shí)，200 μg/mL PHF處理組HaCaT細(xì)胞遷移至部分融合。以上結(jié)果表明PHF能有效促進(jìn)傷口的愈合。

2.6 PHF對(duì)RAW264.7細(xì)胞TGF-β1、TNF-α、IL-6表達(dá)的影響

進(jìn)一步檢測(cè)了不同質(zhì)量濃度的PHF對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力及細(xì)胞因子TGF-β1、TNF-α、IL-6表達(dá)的影響，結(jié)果如圖6所示。

注：與空白對(duì)照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

由圖6A可見，與空白對(duì)照組相比，50 μg/mL的PHF及EGF對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活力無顯著影響，而中、高質(zhì)量濃度(100、200 μg/mL)的PHF可顯著提升RAW264.7細(xì)胞的活力。

TGF-β1是皮膚傷口愈合的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子。已有研究表明，由T細(xì)胞釋放的TGF-β通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和免疫調(diào)節(jié)，對(duì)傷口愈合產(chǎn)生多效作用[18-19]。He等[20]報(bào)道蛙類來源的肽在巨噬細(xì)胞中通過誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)，顯著激活下游依賴TGF-β的Smad信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。由圖6B可見，PHF以濃度依賴的方式顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，200 μg/mL的PHF給藥后，細(xì)胞上清液中TGF-β1的水平增加至(304.00±8.00)pg/mL(空白對(duì)照組的水平為(214.77±5.82)pg/mL)。結(jié)果說明PHF可誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。

由圖6C可見，PHF以濃度依賴的方式顯著促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)，50、100、200 μg/mL的PHF給藥后，細(xì)胞上清液中TNF-α的水平分別增加至(3 003.94±14.37)、(5 788.39±6.74)、(6 384.50±26.23)pg/mL(空白對(duì)照組的水平為(53.94±2.55)pg/mL)。由圖6D可見，與空白對(duì)照組相比，100、200 μg/mL的PHF顯著促進(jìn)了小鼠巨噬細(xì)胞中IL-6的表達(dá)，表達(dá)水平分別提升至4.42、21.52倍。然而，與空白對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組EGF對(duì)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)沒有顯著差異，表明EGF不影響傷口愈合過程中的炎癥期。結(jié)果說明PHF促進(jìn)了RAW264.7細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，激活了傷口愈合過程中的炎癥信號(hào)。

2.7 PHF的分子質(zhì)量分布

采用MALDI-TOF-MS分析PHF的分子質(zhì)量分布，結(jié)果如圖7所示。由圖7A可見，信號(hào)峰在m/z范圍為500～1 300 時(shí)較為集中，信號(hào)最強(qiáng)的質(zhì)子峰在m/z為560左右。由圖7B可見，m/z在2 000及以上時(shí)，基本無信號(hào)峰。以上結(jié)果說明，PHF的分子質(zhì)量主要集中在500～1 300 Da。按照氨基酸殘基平均分子質(zhì)量110 Da估算，PHF主要為含有4～11個(gè)氨基酸的多肽。

注：A.m/z范圍為500～4 000；B.m/z范圍為1 000～20 000。

3 結(jié) 論

本研究以家蠅蛹為原料，用10種不同蛋白酶酶解法制備家蠅蛹多肽(PHP)，結(jié)果表明風(fēng)味蛋白酶酶解法對(duì)于制備高得率、高水解度和高多肽含量的PHP具有較好的優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多種蛋白酶酶解制備的PHP對(duì)HaCaT細(xì)胞均有較好的促增殖活性及促遷移活性。其中，PHF(分子質(zhì)量主要分布在500～1 300 Da之間)可能通過促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，以影響細(xì)胞增殖、遷移及炎癥信號(hào)的傳遞從而加速傷口愈合。研究結(jié)果提示PHF具有被開發(fā)成新型天然促傷口愈合劑的潛力。今后將進(jìn)一步對(duì)PHF進(jìn)行純化，以明確發(fā)揮活性的多肽單體。