王亞萍，姚小華，常 君，任華東，張成才

(中國林業(yè)科學研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，杭州 311400)

薄殼山核桃(Caryaillinoensis(Wangenh.) K. Koch.)，又名美國山核桃、長山核桃，是胡桃科山核桃屬植物，原產于美國和墨西哥，是世界上重要的干果樹種之一，也是珍貴的干果和木本油料樹種[1]。薄殼山核桃殼薄易剝，出仁率高，果仁中富含油脂、蛋白質、碳水化合物，還含有對人體有益的維生素和礦質元素等[2]，具有較高的營養(yǎng)和保健價值。與我國的核桃(JuglansregiaL.)和山核桃(CaryacathayensisSary.)相比，薄殼山核桃具有明顯的易于機械剝殼取仁、果味純正、貯藏性好等優(yōu)點，其油脂是高檔優(yōu)質的木本食用油[3]。目前，國內對薄殼山核桃的研究主要集中在產地及其分布、生態(tài)要求、生物學特性、品種類型、繁殖培育、病蟲害防治、栽培技術、生長發(fā)育、遺傳多樣性、品種鑒定和化學成分等方面[4-5]。隨著薄殼山核桃產量的增大和人們營養(yǎng)保健意識的增強，有必要對薄殼山核桃油的加工及開發(fā)利用進行研究。

水酶法提油具有條件溫和、無需經高溫高壓及有機溶劑處理，能夠較完整地保留油脂固有的天然活性成分等特點，目前國內已在核桃油[6-9]和山核桃油[10-12]提取方面有相關研究，但在薄殼山核桃油提取方面還鮮見報道。

本研究以薄殼山核桃仁為原料，采用水酶法提取薄殼山核桃油，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗優(yōu)化，探求水酶法提取薄殼山核桃油的最佳工藝條件，旨在更好地利用薄殼山核桃資源，開發(fā)具有高附加值的薄殼山核桃油產品，推動國內水酶法提取薄殼山核桃油在生產中的應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

薄殼山核桃堅果，建德市敏捷家庭農場有限公司。將薄殼山核桃堅果去殼，堅果仁(含油率為70.03%)用粉碎機粉碎為0.425 mm(40目)左右的顆粒。

蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、植物復合水解酶，諾維信(中國)生物技術有限公司。4種酶制劑的特性見表1。

表1 4種酶制劑的特性

180E-Y耐歐小型粉碎機；R-3旋轉蒸發(fā)儀、B-811索氏提取儀，瑞士布奇公司；BS-1F全溫度振蕩培養(yǎng)搖床；GC-2010 plus氣相色譜儀、UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；Agilent 1290高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Avanti J-E高速冷凍離心機，德國貝克曼公司；ZYJ-9018家用榨油機。

1.2 試驗方法

1.2.1 水酶法提油

稱取5 g粉碎的薄殼山核桃仁，裝入50 mL離心管中，按一定料液比加入蒸餾水，調節(jié)pH，于90℃水浴中滅酶10 min，然后快速冷卻。加入一定量的酶制劑，混勻后于一定溫度搖床(轉速120 r/min)酶解一定時間，結束后于90℃水浴中滅酶10 min，冷卻，于10 000 r/min離心20 min，用移液槍小心吸取上層清油，離心管內的殘油再用10 mL正己烷分3次溶解后傾出，傾出液合并，旋轉蒸發(fā)除去溶劑后與上層清油合并，稱重后于4℃冷藏備用。按下式計算油脂提取率(Y)。

Y=m1/(m0×C)×100%

(1)

式中：m1為清油質量，g；m0為薄殼山核桃仁質量,g；C為薄殼山核桃仁含油率。

1.2.2 溶劑浸提法提油

稱取20 g粉碎的薄殼山核桃仁，加入石油醚(沸程30～60℃)于50℃浸提8 h，在50℃下旋轉蒸發(fā)除去石油醚，得到薄殼山核桃油，于4℃冷藏備用。

1.2.3 壓榨法制油

稱取20 g薄殼山核桃仁放入榨油機，選擇冷榨模式，壓榨、過濾后用無水硫酸鈉脫水，得到薄殼山核桃油，于4℃冷藏備用。

1.2.4 測定方法

酸值測定采用GB 5009.229—2016方法，過氧化值測定采用GB 5009.227—2016方法，脂肪酸測定采用GB 5009.168—2016(第三法)，生育酚測定采用GB 5009.82—2016(第二法)，總酚測定采用LS/T 6119—2017，角鯊烯測定采用LS/T 6120—2017，β-谷甾醇測定采用NY/T 3111—2017。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進行基礎數(shù)據(jù)處理、分析與作圖。采用SPSS 19.0作正交試驗并進行顯著性及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 酶制劑的篩選

設置加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，料液比為1∶4，纖維素酶、果膠酶、植物復合水解酶的酶解pH均為4.5，蛋白酶酶解pH為7.5，酶解溫度為50℃(水浴)，酶解時間為2.0 h。以山核桃油提取率為指標，考察酶制劑的影響，結果見圖1。

圖1 不同酶制劑對薄殼山核桃油提取率的影響

植物細胞的細胞壁主要由果膠和纖維素、半纖維素、木質素等多糖類物質組成，其中嵌入一些功能性蛋白質，油脂通常與其他大分子物質(蛋白質、碳水化合物等)結合構成脂多糖、脂蛋白等復合體。因此，采用酶解工藝可以快速有效地瓦解細胞壁結構，促使細胞內物質釋放出來[13]。由圖1可見，與纖維素酶、果膠酶和植物復合水解酶3種酶制劑相比，蛋白酶的酶解效果最好，薄殼山核桃油提取率最高，這可能是由于在提取過程中蛋白酶酶解了細胞中包被在油脂周圍的蛋白質和蛋白質膜，使細胞壁結構瓦解，從而促進了油脂從脂質體中釋放出來[14]。因此，選擇蛋白酶進行后續(xù)的酶解工藝優(yōu)化。

2.2 蛋白酶酶解工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 料液比

理論上，加水量越大油脂提取率越高[15]，適宜的料液比可以使溶液具有較好的流動性，有利于酶解反應的進行，從而有效提高油脂的提取率。設置料液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，在酶解pH 7.5、加酶量2.0%、酶解溫度50℃、酶解時間2.0 h條件下，考察料液比對薄殼山核桃油提取率的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖2可見，當料液比從1∶3增加到1∶4時，提取率從61.37%提高到63.49%，此后隨著料液比的繼續(xù)增大，提取率呈顯著下降趨勢(P<0.05)。這是由于酶解體系中溶劑(水)的量過低時，酶解液黏稠，不利于酶與底物的充分接觸，使得酶解反應不徹底，不利于油脂分子充分遷移出來；溶劑(水)的量過高時，酶解液的濃度降低，酶與底物分子的碰撞概率降低，酶解反應的效率也隨之降低[16]。因此，選擇料液比為1∶4。

2.2.1.2 加酶量

加酶量會影響酶與底物的接觸概率，進而影響酶促反應效率，其是影響油脂提取率的重要因素之一。設置加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，在料液比1∶4、酶解溫度50℃、酶解時間2.0 h、酶解pH 7.5條件下，考察加酶量對薄殼山核桃油提取率的影響，結果見圖3。

圖3 加酶量對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖3可見，在加酶量1.0%時提取率為67.59%，此后隨加酶量的增加，酶解體系中的酶濃度增大，酶與底物的接觸概率增大，促進酶解反應的進行，進而增加油脂的提取率[17]。當加酶量增大到2.0%時，薄殼山核桃油提取率達到最大值(70.83%)，當加酶量繼續(xù)增加時，提取率開始下降。這是由于底物的量有限，繼續(xù)增大加酶量，過量的酶會附著在薄殼山核桃仁表面，影響了油脂的釋放；同時，加酶量過多也易使酶解體系發(fā)生深度水解，水解產物增強蛋白質的乳化性，使油脂分子再度被蛋白質包裹，產生乳化現(xiàn)象，增加了油脂的分離難度；另外，加酶量過多會使酶分子間產生競爭作用，降低了酶的作用效率，致使薄殼山核桃油提取率降低[18]。因此，選擇加酶量為2.0%。

2.2.1.3 酶解時間

一般來說，酶解時間越長，物料細胞的降解程度越大，油脂提取率越高，但酶解時間過長也可能使體系中乳狀液趨于穩(wěn)定，造成破乳困難。設置酶解時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，在料液比1∶4、酶解pH 7.5、加酶量2.0%、酶解溫度50℃條件下，考察酶解時間對薄殼山核桃油提取率的影響，結果見圖4。

圖4 酶解時間對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖4可見，酶解時間為1.0 h時，提取率為65.61%，1.5 h時提取率稍有下降(64.31%)但不顯著(P>0.05)，當酶解時間延長至2.0 h時，提取率達到峰值(69.87%)，此后隨著酶解時間的繼續(xù)延長提取率稍微下降。這可能是由于底物的量和酶的總量有限，反應完全后停止酶解，持續(xù)延長時間不會增加提取效率還可能會加重油脂乳化現(xiàn)象[19]，從而導致提取率在酶解2.0 h后有所下降。且酶解時間過長，易使油脂發(fā)生氧化導致油脂品質下降[20]。因此，選擇酶解時間為2.0 h。

2.2.1.4 酶解溫度

酶解溫度過高或過低都不利于油脂的提取，升高溫度能夠提高反應體系的活化能進而提高反應速率，但過高的溫度又會使酶失活，因此適當?shù)拿附鉁囟仁种匾猍21]。設置酶解溫度分別為40、45、50、55、60℃，在料液比1∶4、酶解pH 7.5、加酶量2.0%、酶解時間2.0 h條件下，考察酶解溫度對薄殼山核桃油提取率的影響，結果見圖5。

圖5 酶解溫度對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖5可見，隨酶解溫度升高，提取率先增大后降低，在55℃時提取率達到最大，為66.50%。這是由于隨溫度升高酶解反應的速率增大，相同反應時間內細胞壁裂解程度加大，有利于油脂從細胞中釋放出來；同時，酶解體系溫度升高可以增大分子擴散系數(shù)，降低溶劑及油脂的黏度，加快油脂分子的擴散速度[22]；過高的溫度超過了蛋白酶的最適溫度，酶活力降低，酶解反應速度降低，從而導致提取率下降。因此，選擇酶解溫度為55℃。

2.2.1.5 酶解pH

酶解pH既影響酶的活性，又影響油脂的提取和分離。設置酶解pH分別為5、6、7、8、9，在料液比1∶4、加酶量2.0%、酶解溫度50℃、酶解時間2.0 h條件下，考察酶解pH對薄殼山核桃油提取率的影響，結果見圖6。

圖6 酶解pH對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖6可見，酶解pH由5增大到7時，提取率逐漸下降，但變化不顯著(P>0.05)，當酶解pH增至8時，提取率最高。這可能是因為過高或過低的pH均會影響酶的空間構象，從而影響酶的活力，當酶解體系的pH逐漸接近蛋白酶的最適pH時，蛋白酶活力升高，酶反應速度加快[23]；而當酶解pH大于8時，蛋白酶活力下降，同時pH過高時溶液的乳化程度提高，導致提取率下降[24]。因此，選擇酶解pH為8。

2.2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以蛋白酶為酶制劑，選取料液比、加酶量、酶解溫度、酶解時間和酶解pH為因素，以薄殼山核桃油提取率為指標，進行五因素四水平正交試驗，優(yōu)化水酶法提取薄殼山核桃油的工藝條件。正交試驗因素水平、正交試驗設計和結果分別見表2和表3。

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗設計和結果

續(xù)表3

由表3可知，5個因素對薄殼山核桃油提取率影響的主次順序為加酶量>酶解pH>酶解溫度>酶解時間>料液比，即加酶量對薄殼山核桃油提取率的影響最大，酶解pH和酶解溫度次之，料液比的影響最小。薄殼山核桃油的最佳提取條件為A2B3C3D2E4，即料液比1∶4、加酶量2.5%、酶解溫度55℃、酶解時間2.0 h、酶解pH 8。在最佳條件下進行驗證試驗，薄殼山核桃油提取率達到68.44%。

2.3 制油方法對薄殼山核桃油品質的影響

2.3.1 薄殼山核桃油的酸值、過氧化值及脂肪酸組成(見表4)

由表4可知，薄殼山核桃油中主要含有7種脂肪酸，分別是棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸和順-11-二十碳烯酸，其中不飽和脂肪酸含量高達90%以上，且以油酸和亞油酸為主，油酸含量最高，達70%以上，亞油酸含量在15%以上。對比3種制油方法，水酶法制取的薄殼山核桃油中油酸含量最高，為73.82%，顯著高于溶劑浸提法和壓榨法(P<0.05)。3種制油方法中，水酶法制取的薄殼山核桃油過氧化值和酸值最低，與溶劑浸提法和壓榨法相比，過氧化值分別降低了62.5%和25.0%，酸值分別降低了14.3%和42.5%?？梢姡阜ǜ欣诒３直ど胶颂矣偷钠焚|。

表4 不同方法制取的薄殼山核桃油的酸值、過氧化值、脂肪酸組成及含量

2.3.2 薄殼山核桃油中的活性物質(見表5)

表5 不同方法制取的薄殼山核桃油中的活性物質及含量

由表5可見，薄殼山核桃油中含有α-生育酚和γ-生育酚，且以γ-生育酚為主。3種方法制取的薄殼山核桃油中γ-生育酚含量呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)，以水酶法的最高，達21.00 mg/100 g；此外，水酶法制取的薄殼山核桃油中的總酚、角鯊烯和β-谷甾醇含量均極顯著高于其他兩種方法(P<0.01)。

對不同方法制取的薄殼山核桃油的過氧化值、酸值、主要脂肪酸與其活性物質進行了相關性分析，結果如表6所示。

表6 薄殼山核桃油的過氧化值、酸值、主要脂肪酸與其活性物質的相關性

由表6可以看出：薄殼山核桃油的過氧化值與生育酚和β-谷甾醇含量存在極顯著的負相關，與總酚含量存在顯著的負相關；酸值與油酸、角鯊烯含量存在顯著的負相關，說明油脂中較高含量的生育酚、總酚、β-谷甾醇、角鯊烯和油酸更有利于油脂品質的保持。因此，水酶法制取的薄殼山核桃油中較高的生育酚、總酚、β-谷甾醇、角鯊烯和油酸含量，使得薄殼山核桃油具有較高的抗氧化性。

3 結 論

(1)蛋白酶可作為水酶法提取薄殼山核桃油的適宜酶制劑。薄殼山核桃油的最佳提取工藝條件為：料液比1∶4，加酶量2.5%，酶解溫度55℃，酶解時間2.0 h，酶解pH 8。在最佳提取工藝條件下，薄殼山核桃油提取率為68.44%。

(2)薄殼山核桃油中含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸和順-11-二十碳烯酸7種主要脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量高達90%以上，且以油酸和亞油酸為主，油酸含量高達70%以上，亞油酸含量在15%以上，是一種優(yōu)質木本食用油。

(3)與傳統(tǒng)制油方法相比，水酶法制取的薄殼山核桃油中生育酚、總酚、β-谷甾醇和角鯊烯含量較高，水酶法是一種較為理想的油脂提取方法。