余曉雯，劉 茜，劉 妍，趙軍英，胡聚峰，李 瑩，楊軼涵，陳歷俊

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱150030； 2.北京三元食品股份有限公司 國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京市乳品工程技術(shù)研究中心，母乳研究技術(shù)創(chuàng)新中心，北京 100163)

母乳中的成分高達(dá)2 000多種，含有大量嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。脂質(zhì)作為母乳中嬰幼兒最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，在母乳中占3%～5%，為0～6個(gè)月內(nèi)的嬰兒提供40%～50%的能量，參與嬰幼兒多個(gè)器官快速生長(zhǎng)[2]，對(duì)嬰幼兒胃腸道功能[3]、身體發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[4]和免疫系統(tǒng)發(fā)育[5]等具有有益影響。

甘油三酯(TAG)是母乳脂質(zhì)中含量最高的成分，約占全部脂質(zhì)的98%。母乳脂質(zhì)中，超過70%的棕櫚酸位于TAG甘油骨架sn-2位[6-7]，其他的不飽和脂肪酸(UFA)，如油酸和亞油酸大部分位于TAG甘油骨架sn-1,3位。棕櫚酸在甘油三酯sn-2 位具有促進(jìn)嬰幼兒對(duì)鈣等礦物質(zhì)的吸收[8-9]、軟便的形成，緩解嬰幼兒哭鬧[10]等效果。母乳脂質(zhì)中TAG多以USU形式存在[11-12]，其中1,3-二油?；?2-棕櫚酰基甘油三酯(1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol, OPO)和1-油?；?2-棕櫚酰基-3-亞油?；视腿?1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol, OPL)為母乳中含量最豐富的兩種TAG。研究表明，不同國(guó)家和地區(qū)的母乳中OPL與OPO的含量存在差異，主要表現(xiàn)為中國(guó)母乳中OPL含量普遍高于OPO含量，而歐美國(guó)家恰恰相反。當(dāng)前市售的嬰幼兒配方奶粉脂質(zhì)在脂肪酸種類上與母乳脂質(zhì)沒有明顯差異，但在脂肪酸含量和TAG甘油骨架位置上仍有較大區(qū)別，添加到嬰幼兒配方奶粉中的植物油在sn-2位上的棕櫚酸水平較低，相反，其在sn-1,3位上有較高水平[13]，如Sun等[14]通過測(cè)定180個(gè)市售嬰幼兒配方奶粉脂質(zhì)，發(fā)現(xiàn)配方奶粉脂質(zhì)TAG結(jié)構(gòu)和含量與成熟期的母乳脂質(zhì)有顯著差異，且配方奶粉脂質(zhì)中OOO含量較為豐富；Chen等[15]通過分析市售標(biāo)有添加OPO嬰兒配方奶粉脂質(zhì)的TAG組成發(fā)現(xiàn)，嬰兒配方奶粉中除了含有OPO，也存在一定比例的PPO。目前，我國(guó)嬰幼兒配方奶粉多是通過添加OPO來模擬母乳脂質(zhì)，這與中國(guó)母乳脂質(zhì)TAG組成不完全相同。為進(jìn)一步研究OPL對(duì)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本文對(duì)母乳中OPL的功能、不同國(guó)家和地區(qū)母乳中OPL含量及檢測(cè)方法進(jìn)行闡述，以期為結(jié)合中國(guó)母乳特征開發(fā)更適宜中國(guó)嬰幼兒的人乳替代脂提供參考。

1 母乳中OPL的功能

母乳脂質(zhì)在嬰兒發(fā)育方面具有重要意義，其TAG的脂肪酸組成和含量對(duì)一些代謝調(diào)節(jié)有影響[16-17]。OPL化學(xué)結(jié)構(gòu)中sn-2位為飽和脂肪酸(SFA)棕櫚酸，sn-1位和sn-3位為UFA。母乳中OPL在胃腸道被脂肪酶水解成sn-2單甘油酯和游離脂肪酸，在嬰幼兒的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、骨骼生長(zhǎng)以及腸道菌群的正常發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用[18]。

Bar-Yoseph等[19]在一項(xiàng)雙盲實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)sn-2位棕櫚酸對(duì)嬰幼兒糞便中脂肪和鈣的含量存在影響，喂養(yǎng)含有sn-2位棕櫚酸配方奶粉的嬰幼兒相較于普通嬰幼兒配方奶粉組，糞便中脂肪含量明顯較低，減少了鈣皂化脂肪的排泄。Béghin等[20]實(shí)驗(yàn)證明，棕櫚酸在sn-2位能改善嬰幼兒糞便的黏稠度以及提高骨骼礦物質(zhì)含量，這是由于處在sn-2位的棕櫚酸不易與鈣離子結(jié)合形成不溶性鈣皂，進(jìn)而改善便秘和促進(jìn)鈣的吸收。Litmanovitz等[21]也進(jìn)一步證明sn-2位為棕櫚酸的結(jié)構(gòu)脂能改善嬰兒糞便硬度，減少便秘，并且能降低嬰兒啼哭頻率。Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)sn-2位棕櫚酸結(jié)構(gòu)脂小鼠對(duì)鈣的吸收率約48.45%，高于喂養(yǎng)混合植物油組(代表傳統(tǒng)嬰幼兒配方奶粉)的小鼠(38.43%)，還發(fā)現(xiàn)這類結(jié)構(gòu)脂可以誘導(dǎo)小鼠腸道內(nèi)的雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，減少致病菌的數(shù)量，這與Yaron 等[23]的研究結(jié)果一致：以母乳和sn-2位棕櫚酸甘油酯組喂養(yǎng)的嬰兒腸道菌群中乳酸桿菌和雙歧桿菌增加。

油酸和亞油酸作為母乳中主要的脂肪酸，為乳脂肪球的形成、運(yùn)輸和代謝提供了流動(dòng)性[24]。早期對(duì)以油酸和亞油酸為主的飲食研究顯示，與油酸相比，嬰兒飲食以亞油酸為主的多不飽和脂肪酸(PUFA)似乎更能降低膽固醇水平[25]。但其他研究中提到，亞油酸的過量攝入與非典型神經(jīng)發(fā)育有關(guān)[26]。Oosting等[27]研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒攝入母乳或奶粉中的亞油酸和α-亞麻酸會(huì)影響大腦中n-3和n-6 PUFA的合成，這兩者之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，亞油酸攝入過高可能會(huì)抑制內(nèi)源性n-3 PUFA的合成和循環(huán)，會(huì)對(duì)嬰幼兒大腦產(chǎn)生一定的影響。在近年來的規(guī)范中，許多國(guó)家都有調(diào)整嬰幼兒配方奶粉中亞油酸的比例，但也強(qiáng)調(diào)這還需要更多臨床上的證據(jù)來支持[28]。

也有通過體外對(duì)比研究，分析OPL的功能，如Zhang等[29]采用OPL、OPO和1，3-二亞油?；?2-棕櫚油基甘油三酯(LPL)來體外模擬嬰兒胃腸道對(duì)脂質(zhì)的代謝，發(fā)現(xiàn)OPL和LPL的消化率均低于OPO，推測(cè)原因：一是OPO的粒徑比OPL和LPL小，與酶接觸面積大且油酸與胰酶結(jié)合能力強(qiáng)，更易從油滴表面脫落；二是雙鍵阻礙了與酶結(jié)合。另外，實(shí)驗(yàn)還采用Caco-2細(xì)胞模擬TAG在小腸上皮細(xì)胞的合成和分泌，結(jié)果顯示在Caco-2細(xì)胞中OPL、LPL的合成和運(yùn)輸高于OPO，這與OPL組中FABP1、PPARα和MTT蛋白的表達(dá)顯著高于OPO組有關(guān)，表明OPL更利于吸收和運(yùn)輸。此外，該團(tuán)隊(duì)[30]進(jìn)一步考察了在體外肝細(xì)胞(LO2細(xì)胞)中OPL、LPL和OPO對(duì)脂質(zhì)代謝的影響，結(jié)果表明，盡管OPL、LPL和OPO均能改變參與脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，進(jìn)而引起脂質(zhì)在肝細(xì)胞代謝的變化，但是OPL相對(duì)于LPL和OPO更容易引起LO2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的堆積，但這是否有利于嬰幼兒的生長(zhǎng)和發(fā)育還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前臨床研究缺少直接對(duì)嬰幼兒喂養(yǎng)OPL含量高的母乳或嬰幼兒配方奶粉的數(shù)據(jù)，并且OPL在制備上也存在著諸多困難，因此如何解決OPL制備過程中的酰基遷移和操作復(fù)雜等問題還需要不斷研究[31-32]。而目前只從脂肪酸對(duì)比和體外研究來分析OPL對(duì)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響，還需要考慮其他因素的干預(yù)或影響。

2 不同國(guó)家和地區(qū)母乳中OPL含量

不同的生活環(huán)境、飲食習(xí)慣等，導(dǎo)致不同地區(qū)母親分泌的乳汁有所差異[33]。表1列舉了不同國(guó)家和地區(qū)的母乳脂質(zhì)中OPL和OPO的含量。

表1 不同國(guó)家和地區(qū)母乳脂質(zhì)中OPL和OPO的含量

Morera[34]、Pons[35]等利用HPLC-ELSD分析了西班牙47個(gè)不同哺乳時(shí)期的母乳脂質(zhì)中TAG組成，共分離出30種TAG，得出OPL含量低于OPO(OPO含量為17.56%～42.44%，OPL含量為9.24%～38.15%)。Ten-Doménech等[36]收集了西班牙巴倫西亞地區(qū)不同階段的母乳，采用HPLC-ELSD對(duì)母乳中脂質(zhì)TAG組成進(jìn)行分析，得出OPO含量約為20%，OPL含量約為10%。Kallio等[37]對(duì)芬蘭和中國(guó)母乳樣本進(jìn)行分析，通過HPLC-MS在電噴霧(ESI)離子源檢測(cè)下，得到數(shù)百個(gè)TAG的同分異構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)芬蘭母乳脂質(zhì)中含量較高的TAG是OPO(9.4%)，其次是OPL(5.4%)，而中國(guó)母乳脂質(zhì)含量較高的TAG是OPL(10.3%)，OPO(7.1%)次之，該研究還指出油酸通常在TAG的sn-1,3位，但當(dāng)存在亞油酸則油酸不一定在sn-1, 3位。

Wu等[38]采用HPLC/串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF-MS)并使用ESI離子源測(cè)定52份北京地區(qū)母乳脂質(zhì)脂肪酸和TAG的組成和含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)母乳脂質(zhì)中油酸與亞油酸的含量與母親飲食中的豆類、海鮮及堅(jiān)果等有關(guān)，OPL含量在10.31%～14.17%之間，而OPO含量為7.29%～11.91%。Zhang等[39]使用超高效合相色譜UPC2/Q-TOF-MS測(cè)定無錫地區(qū)母乳樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母乳脂質(zhì)中OPL含量為12.60%～19.35%，占總TAG的10.82%，OPO含量為7.98%～17.06%，占總TAG的8.80%。Zhao等[40]研究北京地區(qū)的母乳脂質(zhì)TAG含量，采用UPLC/Q-TOF-MS在ESI正負(fù)離子檢測(cè)模式下分析得出OPL、OPO含量分別為14.09%和12.80%，且研究表明棕櫚酸主要分布在母乳TAG的sn-2位。

Tu等[41]利用超臨界流體色譜(SFC)結(jié)合Q-TOF-MS分析，檢測(cè)了湖北、四川和北京3個(gè)地區(qū)54份母乳脂質(zhì)TAG的組成和含量，結(jié)果表明：湖北、北京和四川3個(gè)地區(qū)過渡乳與成熟乳TAG種類存在差異；但是無論過渡乳還是成熟乳，OPL含量皆高于OPO含量，且過渡乳中OPL含量高于成熟乳的OPL含量。Yuan等[42]利用HPLC-MS配備大氣壓化學(xué)電離(APCI)離子源研究分析無錫地區(qū)103位母親初乳到成熟乳TAG組成的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)期母乳脂質(zhì)的脂肪酸譜存在顯著差異；OPO在初乳、過渡乳和成熟乳的脂質(zhì)中含量分別為19.50%、14.09%和13.91%，始終低于OPL含量(分別為28.08%、23.24%和24.98%)。

通過比較不同國(guó)家、不同地區(qū)以及不同泌乳期母乳中OPO和OPL的含量(不區(qū)分異構(gòu)體)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)母乳中OPL含量高于OPO[43]，這與歐美國(guó)家恰好相反，而且中國(guó)母乳中油酸與亞油酸的比例也低于歐美國(guó)家[44-45]。從飲食方面分析認(rèn)為，歐美多數(shù)國(guó)家日常攝入奶酪、黃油及橄欖油等低碳水、高脂肪的食物[46]，是母乳脂質(zhì)中油酸含量高于中國(guó)的因素之一。而中國(guó)人群大多數(shù)食用的植物油(如大豆油、葵花籽油等)亞油酸[45-48]含量高，且豆制品的攝入也可以提高母乳脂質(zhì)中亞油酸的含量[49]。因此，飲食習(xí)慣可能是中國(guó)母乳脂質(zhì)中OPL含量高于OPO的重要原因之一。另外，3個(gè)泌乳期中，成熟乳中OPL含量相對(duì)較低。

3 母乳中OPL的檢測(cè)方法

根據(jù)脂肪酸在甘油骨架sn-2位和sn-1, 3位酯化位置不同而產(chǎn)生位置異構(gòu)體或稱為區(qū)域異構(gòu)體(TAG碳鏈上脂肪酸位置不同，而非脂肪酸鏈上雙鍵位置差異)。此外，不同的脂肪酸酯化在甘油骨架sn-1位和sn-3位會(huì)具有旋光活性，導(dǎo)致對(duì)映異構(gòu)體[50]。OPL和OPO作為母乳中含量最高的兩種TAG，其主要的對(duì)映異構(gòu)體被證明為rac-OPL(指外消旋后OPL中包含OPL和LPO兩種結(jié)構(gòu)脂)和rac-OPO[37]?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法普遍是對(duì)乳中總TAG的檢測(cè)，得出乳中OPL的含量，一般不區(qū)分脂肪酸在甘油骨架上的位置。目前有研究結(jié)合生物法即添加脂肪酶對(duì)TAG特定位置的酯鍵進(jìn)行水解后再進(jìn)行測(cè)定，該方法在OPO的檢測(cè)中較為成熟，因?yàn)橐戎久改苤苯铀鈙n-1，3位脂肪酸，并能對(duì)sn-2位進(jìn)行確定。有研究顯示，胃脂肪酶對(duì)TAG的sn-3位有一定的特異性[51]，能水解得到sn-3位脂肪酸。但是通過胃脂肪酶水解OPL建立檢測(cè)方法并沒有得到應(yīng)用，原因可能是胃脂肪酶對(duì)中短鏈脂肪酸的水解活性強(qiáng)于長(zhǎng)鏈脂肪酸[52-53]。

早在1988年就有研究采用GC分析TAG，如玻璃毛細(xì)管、熔融二氧化硅毛細(xì)管等對(duì)TAG定量分析[54]。但該方法的缺點(diǎn)是帶有PUFA的TAG極易在檢測(cè)中損失，因此該方法逐漸被淘汰。目前，無論是氣相色譜法還是液相色譜法都會(huì)結(jié)合質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，從而得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，如氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)以及超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)等[55]。質(zhì)譜可以通過準(zhǔn)分子離子的準(zhǔn)確質(zhì)量分別精確計(jì)算TAG和甘油二酯(DAG)的分子式，并通過片段離子[M+H-FA]+推導(dǎo)出甘油骨架上的脂肪酸酰基。在TAG中，sn-1，3位的脂肪酸?；萻n-2位的更容易斷裂，并產(chǎn)生不同豐度的[M+H-FA]+[56]，因此可通過碎片的強(qiáng)度初步確定脂肪酸在甘油骨架上的位置。近年來，對(duì)OPL的位置異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體的分離開始采用銀離子高效液相色譜(Ag+-HPLC)或帶有手性色譜柱的液相色譜法分離，再結(jié)合帶有大氣壓化學(xué)電離離子源的質(zhì)譜(APCI-MS)對(duì)分離的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明TAG的異構(gòu)體在一定條件下能被明顯表示，而且采用化學(xué)電離能規(guī)避電子碰撞電離在識(shí)別上的問題。

Kurvinen等[57]采用化學(xué)電離質(zhì)譜法測(cè)定脂肪酸在TAG中相對(duì)分子質(zhì)量分布，采用碰撞誘導(dǎo)解離串聯(lián)質(zhì)譜法確定母乳和母乳替代品中脂肪酸在TAG中sn-2位和sn-1，3位的分布。Zou等[58]用Ag+-HPLC和手性高效液相色譜分別與APCI-MS聯(lián)用，對(duì)母乳脂質(zhì)中TAG位置異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體(rac-OOP/rac-OPO)進(jìn)行了分離和鑒定，但其他重要的TAG如1-月桂?；?2,3-二油?；视腿?LaOO)和OPL的位置異構(gòu)體尚未分離。Nagai等[59]采用手性高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了TAG位置異構(gòu)體與對(duì)映異構(gòu)體的分離，采用Chiralpak IF-3 色譜柱同時(shí)分離POL、SOL(1-硬脂酸-2-油酸-3-亞油酸甘油三酯)和PSO(1-棕櫚酸-2-硬脂酸-3-油酸甘油三酯)混合TAG，聯(lián)合帶有ESI的質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行分析，采用乙腈作為流動(dòng)相(可以減少峰拖尾，原因是乙腈增加了流動(dòng)相的極性和密度)，可以識(shí)別sn-1位和sn-3位的UFA(O或L)，但是對(duì)OPL、LOP、PLO混合物不能完全分離。

張?zhí)m威等[60]設(shè)計(jì)了一種母乳中rac-OPL對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)方法。提出先對(duì)母乳中OPL進(jìn)行靶向收集，即采用連有C18色譜柱的液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定、收集；其次，利用帶有手性色譜柱(Lux Cellulose-1手性色譜柱)的液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜(HPLC-APCI-MS)對(duì)收集的OPL進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rac-OPL的峰得到明顯的分離。該團(tuán)隊(duì)[61]在之前的實(shí)驗(yàn)中分別用帶有銀離子色譜柱和手性色譜柱HPLC-APCI-MS對(duì)母乳中主要TAG進(jìn)行了位置異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體分析，得出了rac-OPL以及其對(duì)映異構(gòu)體的相對(duì)含量，但對(duì)于rac-OPL、rac-POL、rac-PLO混合物的分離仍存在困難，且母乳中也存在基線未分開的情況。

綜上，檢測(cè)OPL的方法通常分為兩個(gè)步驟：分離和鑒定。常見的如高效液相色譜法能測(cè)出母乳中OPL含量，但是在結(jié)構(gòu)上不能得到良好的鑒定。手性色譜法和銀離子色譜法已經(jīng)被用于TAG的分析，但對(duì)于母乳中OPL的檢測(cè)報(bào)道較少。Ag+-HPLC分離原理是固定相中的銀離子與TAG中雙鍵的π電子之間的電荷轉(zhuǎn)移作用分離TAG，雙鍵數(shù)目及位置決定保留時(shí)間[62]；而分析TAG的手性色譜柱的填充物一般多采用纖維素或環(huán)狀糊精的衍生物，對(duì)對(duì)映異構(gòu)體具有選擇性[63]。Ag+-HPLC /APCI-MS可以分離TAG的位置異構(gòu)體但不能分離對(duì)映異構(gòu)體，而手性色譜柱可以解決這一問題，所以實(shí)驗(yàn)中可以通過兩種方法來達(dá)到OPL的分離鑒定。目前已經(jīng)確定rac-OPL能進(jìn)行分離，但由于母乳樣品的復(fù)雜性，分離效果達(dá)不到rac-OPL標(biāo)準(zhǔn)品的效果。也有學(xué)者提出使用一種新型算法[64]對(duì)油脂中的AAB型和ABC型TAG的異構(gòu)體進(jìn)行檢測(cè)，其原理是TAG通過質(zhì)譜中碎片離子的響應(yīng)強(qiáng)度制作校正曲線對(duì)樣品中的TAG異構(gòu)體進(jìn)行定量，但該方法目前沒有運(yùn)用于母乳檢測(cè)中，而且該方法只區(qū)分TAG的位置異構(gòu)體。所以，未來針對(duì)母乳的測(cè)定方法還需要探索，并且需要不斷優(yōu)化條件以區(qū)分更多的脂質(zhì)物質(zhì)。

4 結(jié)束語

OPL作為中國(guó)母乳脂質(zhì)中含量較高的TAG，近年來頗受重視。地理環(huán)境、飲食習(xí)慣等多種因素造成了中國(guó)母乳脂質(zhì)OPL較OPO含量高?，F(xiàn)有OPL的檢測(cè)方法能用于對(duì)其位置異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行分離。但在研究OPL對(duì)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響上，仍舊缺少臨床數(shù)據(jù)。此外，OPL在人乳替代脂產(chǎn)品中的應(yīng)用還較為匱乏。

總體來講，我們還需要更準(zhǔn)確地鑒定母乳中OPL的結(jié)構(gòu)，在考慮結(jié)構(gòu)因素的同時(shí)與OPO進(jìn)行功能上的對(duì)比，這能為采用OPL開發(fā)母乳替代脂提供更充分的理論依據(jù)。目前，需要研究者深入、全面地剖析OPL結(jié)構(gòu)脂，探究其對(duì)生命近遠(yuǎn)期健康的意義，為開發(fā)更接近母乳的嬰幼兒配方奶粉提供科學(xué)證明。