張靜嫻　陳蕾蕾　謝俊霞

[摘要] 目的 研究鐵過載試劑對過表達α-突觸核蛋白（α-syn）誘發(fā)iPC12細胞內(nèi)鈣離子增多的影響。方法 用多西環(huán)素（DOX）處理iPC12細胞48 h，誘導(dǎo)其高表達α-syn。實驗分為對照組、DOX組、DOX+枸櫞酸鐵胺（FAC）組和DOX+去鐵胺（DFO）組。對照組用細胞培養(yǎng)液處理48 h;DOX組用DOX處理48 h;DOX+FAC組給予DOX預(yù)處理24 h后，用FAC處理24 h;DOX+DFO組給予DOX預(yù)處理24 h后，用DFO處理24 h。通過檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度評估細胞鈣穩(wěn)態(tài)。結(jié)果 與DOX組相比，DOX+FAC組細胞內(nèi)鈣離子濃度升高（F=43.84，q=4.074，P<0.05），DOX+DFO組細胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯變化（q=1.430，P>0.05）。結(jié)論 鐵過載可加劇α-syn過表達誘發(fā)的細胞內(nèi)鈣離子水平升高。

[關(guān)鍵詞]鐵;α突觸核蛋白;PC12細胞;鈣

[中圖分類號]R338.2[文獻標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）03-0361-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.102

EFFECT OF IRON ON INTRACELLULAR CALCIUM INCREASE IN IPC12 CELLS INDUCED BY OVEREXPRESSION OF α-SYNUCLEIN

ZHANG Jingxian， CHEN Leilei， XIE Junxia

（Institute of Brain Science and Diseases， Qingdao University， Shandong Provincial Key Laboratory of Pathogenesis and Prevention of Neurological Disorders， Shandong Provincial Collaborative Innovation Center for Neurodegenerative Disorders， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of the iron-overload reagent on intracellular calcium increase in iPC12 cells induced by the overexpression of α-synuclein （α-syn）.?Methods iPC12 cells were treated with doxycycline （DOX） for 48 h to induce the high expression of α-syn. In the experiment， cells were divided into control group， DOX group， DOX+ferric ammonium citrate （FAC） group， and DOX+desferrioxamine （DFO） group. The control group was treated with cell culture fluid for 48 h. The DOX group was treated with DOX for 48 h. The DOX+FAC group was treated with FAC for 24 h after DOX pretreatment for 24 h. The DOX+DFO group was treated with DFO for 24 h after DOX pretreatment for 24 h. Cellular calcium homeostasis was assessed by detecting the intracellular calcium concentration.?Results Compared with the DOX group， the intracellular calcium concentration in the DOX+FAC group was significantly increased （F=43.84，q=4.074，P<0.05）， and no significant change was found in the intracellular calcium concentration in the DOX+DFO group （q=1.430，P>0.05）.?Conclusion Iron overload can aggravate the increase in intracellular calcium concentration induced by the overexpression of α-syn.

[KEY WORDS] iron; alpha-synuclein; PC12 cells; calcium

作為全球第二位的神經(jīng)退行性疾病，帕金森?。≒D）病理特點是黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失，且殘存的細胞內(nèi)存在以α-突觸核蛋白（α-syn）聚集體為主的路易小體并伴有鐵沉積[1-3]。研究表明，寬尖峰動作電位、自主起搏電活動、胞漿鈣振蕩和較低的鈣緩沖能力是黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元區(qū)別于其他神經(jīng)元的重要生理特征，而這種差異可能是PD黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失的重要原因[4-5]。PD中鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可以通過增加超氧化物和活性氧的產(chǎn)生使氧化應(yīng)激水平升高，而氧化應(yīng)激增加是PD中多巴胺能神經(jīng)元死亡的機制之一[6-8]。引起PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡可能與α-syn聚集和鐵沉積有關(guān)，但具體機制尚未完全闡明[9-11]。有研究顯示，聚集形式的α-syn和枸櫞酸鐵銨（FAC）均可以使原代神經(jīng)元細胞質(zhì)中鈣離子增加[9-12]。最近研究表明，經(jīng)錯誤折疊后寡聚體形式的α-syn可使細胞膜完整性破壞，細胞內(nèi)鈣離子增多并誘發(fā)鐵死亡[11]。然而，鐵過載能否加劇α-syn誘發(fā)細胞內(nèi)鈣離子增多這一過程，目前尚不清楚。本研究擬應(yīng)用多西環(huán)素（DOX）誘導(dǎo)iPC12細胞高表達α-syn，并在該細胞模型上探討FAC對過表達α-syn誘發(fā)iPC12細胞內(nèi)鈣離子增多的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料和方法

1.1實驗材料

本實驗所用的iPC12細胞系為穩(wěn)轉(zhuǎn)外源（人）SNCA（A53T）PC12細胞系，PC12細胞系是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤分化細胞株;DMEM高糖培養(yǎng)液和胰蛋白酶購于Hyclone公司;胎牛血清購于依科賽公司;馬血清和GENETIXIN購于Gibco公司;FAC、去鐵銨（DFO）、鈣比色測定試劑盒和DOX均購于Sigma公司;潮霉素B購于賽默飛公司;磷酸酶抑制劑（04906837001）購于羅氏公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)實驗非無菌器具均高壓滅菌烘干后使用。待所用培養(yǎng)液在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱后，將液氮凍存的細胞取出，迅速放置在37 ℃水浴鍋中，快速搖晃至完全融開，將全部細胞懸液轉(zhuǎn)移至10 mL已預(yù)熱的完全培養(yǎng)液中，吹打均勻后以1 000 r/min離心5 min。離心后棄上清液，用5 mL完全培養(yǎng)液重懸細胞，然后轉(zhuǎn)移至25 cm3的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放在細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)（37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO₂）。每4～5 d傳代1次，傳代3次后以1×10⁸/L接種于六孔板中，每孔加2 mL完全培養(yǎng)液。細胞匯合度達70%～80%時進行后續(xù)處理。

1.3實驗分組及處理

為觀察鐵過載對iPC12細胞內(nèi)鈣離子的影響，將細胞隨機分為對照組、DOX組、DOX+FAC組和DOX+DFO組。對照組用細胞培養(yǎng)液處理48 h，DOX組用2 mg/L的DOX處理48 h，DOX+FAC組細胞先給予2 mg/L的DOX處理24 h后再用100 μmol/L的FAC處理24 h，DOX+DFO組給予2 mg/L的DOX處理24 h后再用100 μmol/L的DFO處理24 h。

1.4細胞內(nèi)鈣離子測定

六孔板藥物處理完畢，負壓吸取上清后，使用0.01 mol/L的PBS潤洗1次，吸凈液體，每孔加入100 μL細胞裂解液，置冰上裂解半小時后，用刮板盡可能將細胞刮下，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，4 ℃下以12 000 r/min離心30 min后，吸取85 μL上清。鈣比色測定試劑盒平衡至室溫后，將標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水稀釋至每孔0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 μg。每孔加入待測樣本40 μL，然后用雙蒸水補足至體積50 μL。在標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣本孔中分別加入90 μL顯色試劑，然后每孔加入60 μL鈣緩沖試劑，輕輕混勻后在37 ℃環(huán)境中避光孵育15 min。用酶標(biāo)儀（SpectraMax M5，Molecular Devices）在波長575 nm處測量標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本的吸光度值。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Graph Pad Prism軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料結(jié)果以x±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1鐵過載對過表達α-syn誘發(fā)細胞內(nèi)鈣離子增多的影響

對照組、DOX組和DOX+FAC組的細胞內(nèi)鈣離子濃度分別為（0.192±0.007）、（0.237±0.005）和（0.292±0.017）mmol/L（n=3），3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=43.84，P<0.05）。與對照組相比較，DOX組細胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=3.187，P<0.05）;與DOX組相比，DOX+FAC組細胞內(nèi)鈣離子濃度進一步升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=4.074，P<0.05）。提示FAC可加劇過表達α-syn誘發(fā)的細胞內(nèi)鈣離子水平升高。

2.2DFO對過表達α-syn誘發(fā)細胞內(nèi)鈣離子增多的影響

對照組、DOX組和DOX+DFO組的細胞內(nèi)鈣離子濃度分別為（0.192±0.007）、（0.237±0.005）和（0.216±0.020）mmol/L（n=3），3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.97，P<0.05）。與DOX組相比較，DOX+DFO組細胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯變化（q=1.430，P>0.05）。提示DFO對過表達α-syn誘發(fā)的細胞內(nèi)鈣離子水平升高無明顯影響。

3討論

鈣是細胞內(nèi)調(diào)控重要生命活動的第二信使，細胞質(zhì)內(nèi)的低鈣濃度（100 nmol/L）是細胞信號中靈敏激活鈣級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵[13]。已有研究結(jié)果表明，PD中鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可以通過增加α-syn聚集和線粒體氧化應(yīng)激對細胞產(chǎn)生損傷[6，14]。一方面，鈣除了調(diào)控α-syn分泌外，還可以與其C端結(jié)合，引起非淀粉樣成分結(jié)構(gòu)域變化，促進β-折疊結(jié)構(gòu)形成，從而促進α-syn聚集體的形成[14-15];另一方面，鈣信號可以通過增加超氧化物和活性氧的水平來破壞線粒體復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ[16]。

鈣促進α-syn聚集后，聚集的α-syn可以作用于細胞膜，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，也可以引起細胞氧化損傷[11]。鐵沉積作為PD的顯著病理特征，不僅可以促進α-syn聚集，還可以增加氧化應(yīng)激水平[17-18]。鐵過載在神經(jīng)元細胞上可以通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ryanodine受體，增加細胞內(nèi)鈣離子的水平[12]。雖然α-syn聚集和鐵沉積分別會引起細胞內(nèi)鈣離子水平升高，但卻鮮有研究報道二者共同作用對細胞內(nèi)鈣離子的影響。本研究結(jié)果表明，鐵過載可以加劇α-syn誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣離子濃度增高，但是鐵和α-syn共同作用引起鈣離子變化的機制仍需要進一步研究。本研究結(jié)果還表明，DFO對過表達α-syn誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣離子增多無明顯影響。推測這可能是由于DFO不能進入細胞，無法有效阻斷鐵激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ryanodine受體引起細胞內(nèi)鈣離子增多的過程。黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元自主起搏電活動主要依賴于L型鈣通道的Cav1.3亞型[19]。而且有文獻報道，早期PD病人大腦中Cav1.3/Cav1.2的表達比值增加[20]。由上述研究可知，L型電壓門控通道在PD的鈣穩(wěn)態(tài)失衡中至關(guān)重要。因此，接下來的研究可進一步探索鐵和α-syn引起細胞內(nèi)鈣離子增多時L型電壓門控通道的變化，這為后續(xù)研究PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡機制提供了新的思路。但PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡的具體機制以及PD中異常鈣離子如何流動還有待進一步研究探討。

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（本文編輯馬偉平）