王 莎,王凱杰，姜茹予，陳家俊，袁涵林

(湖州師范學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

病原菌的耐藥性一直是世界關(guān)注的熱點(diǎn).近年來，由于器官移植和外科介入性治療的不斷開展，以及廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等的廣泛應(yīng)用甚至濫用，導(dǎo)致菌群失調(diào)，以致機(jī)體對(duì)真菌的抵抗力降低，在世界范圍內(nèi)侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)感染的發(fā)生呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，且病死率較高[1-2].目前，人們對(duì)人類病原真菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的致病性和耐藥機(jī)制等的研究還不夠深入.當(dāng)前，治療深部曲霉感染臨床應(yīng)用的一線藥物是三唑類抗真菌藥物(trizoles)，如伊曲康唑(itraconazole)、伏立康唑(Voriconazole)和泊沙康唑(posaconazole)[3-4].唑類藥物通過與麥角固醇合成途徑中的關(guān)鍵酶細(xì)胞色素P450羊毛甾醇14α-脫甲基酶(erg11A/cyp51A基因編碼)結(jié)合，抑制麥角固醇的合成，并造成毒性固醇中間體的積累，從而抑制真菌的生長(zhǎng)[5].但研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的臨床分離菌株對(duì)唑類藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥性，其特點(diǎn)是除了對(duì)某種特定藥物耐藥外，還有較高比例的菌株出現(xiàn)多重耐藥性(multidrugresistance)[6-7].

在煙曲霉分離鑒定的前期研究中，筆者得到了一個(gè)與三唑類藥物耐受相關(guān)的基因Afssn3.作為RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄輔因子，Afssn3定位在細(xì)胞核中，其可通過調(diào)節(jié)胞外多糖基質(zhì)、鞘脂合成的中間代謝物和藥物外排活力，實(shí)現(xiàn)對(duì)唑類藥物的耐受性[8].據(jù)報(bào)道，釀酒酵母或白色念珠菌中的ssn3參與多種途徑，如影響碳源利用、生物膜形成和耐藥性[9-10].因此，在真菌中ssn3可通過影響RNA聚合酶II的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響耐藥，如目前眾所周知的生物膜調(diào)控.本研究通過Afssn3缺失菌株在三唑類藥物刺激下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，進(jìn)一步發(fā)掘其在調(diào)控唑類藥物耐受過程中可能的機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

煙曲霉野生菌株A1160來自FGSC(http://www.fgsc.net/)；A1160c野生型對(duì)照菌株和Afssn3敲除菌株(ΔAfssn3)來自本實(shí)驗(yàn)室菌庫(kù).本研究使用的培養(yǎng)基為豐富培養(yǎng)基YAG(0.5%酵母膏、2%葡萄糖、0.1% 1000×微量元素、2%瓊脂).

1.2 菌株的培養(yǎng)與處理

取A1160c和ΔAfssn3菌株各1×107個(gè)孢子于100 mL YAG液體培養(yǎng)基中，220 rpm、37 ℃培養(yǎng) 24 h，之后分別加入終濃度為1 μg/mL的伊曲康唑繼續(xù)培養(yǎng)1 h；收取相應(yīng)菌絲，用雙蒸水洗滌3次，再在液氮中研磨；按照試劑盒的程序，使用TRIzol? Reagent試劑從樣品中分離總RNA.利用Nanodrop 2000檢測(cè)所提RNA的濃度和純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，利用Agilent 2100測(cè)定RIN值.

1.3 文庫(kù)構(gòu)建與上機(jī)測(cè)序

提取樣品的總RNA，并使用DNase消化DNA，再用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入試劑將mRNA進(jìn)行片段化處理，并以mRNA片段為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，配制合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，然后連接不同接頭，再進(jìn)行消化，只保留連接鏈不同接頭的cDNA一鏈；純化cDNA一鏈后，再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢，合格后使用Illumina HiSeqTM 2500或其他測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序.

1.4 生物信息學(xué)分析

采用Illumina測(cè)序平臺(tái)測(cè)得的原始測(cè)序數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行質(zhì)控，過濾低質(zhì)量的測(cè)序片段(reads)，去除3’端低質(zhì)量堿基，切除含氮部分序列，最終得到干凈的數(shù)據(jù)(clean reads)，通過tophat/bowtie2將其比對(duì)到參考序列；比對(duì)完成后統(tǒng)計(jì)測(cè)序片段在參考序列上的分布情況和覆蓋度，并進(jìn)行基因表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化、可變剪接、新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)，以及編碼能力預(yù)測(cè)、SNP檢測(cè)等一系列后續(xù)分析；從基因表達(dá)結(jié)果中篩選出樣品間的差異表達(dá)基因，并基于差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析、基因本體(Gene Ontology，GO)功能顯著性富集分析和通路(pathway)顯著性富集分析.

2 結(jié) 果

2.1 煙曲霉Afssn3缺失后差異表達(dá)基因數(shù)量

本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所產(chǎn)生的測(cè)序序列與參考基因組煙曲霉A1163(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/18?genome_assembly_id=22577)的數(shù)據(jù)相匹配度為90%以上，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的利用率很高，能用于后續(xù)分析.利用htseq軟件(http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/overview.html)獲取每個(gè)樣本比對(duì)到基因上的reads數(shù)，依據(jù)DESeq軟件包(http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html)中的負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)，對(duì)reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，并采用basemean值估算基因表達(dá)量.

本文對(duì)煙曲霉Afssn3缺失菌株和野生型對(duì)照菌株分別用伊曲康唑進(jìn)行處理，并應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)兩組樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序和分析，以野生型菌株為對(duì)照，尋找差異表達(dá)的信號(hào)通路和相應(yīng)基因.結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因(P≤0.05)共有482個(gè)，其中上調(diào)差異基因344個(gè)，下調(diào)差異基因138個(gè)，上調(diào)差異基因多于下調(diào)差異基因.

2.2 Gene Ontology富集分析

在得到差異表達(dá)基因后，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，并對(duì)其功能進(jìn)行描述.基于GO富集分析(圖1)發(fā)現(xiàn)：由伊曲康唑刺激引起上調(diào)的基因被富集到的生物過程包括固醇生物合成過程(sterol biosynthetic process)、細(xì)胞對(duì)鐵離子缺乏的反應(yīng)(cellular response to iron ion starvation)、非核糖體肽生物合成過程(nonribosomal peptide biosynthetic process)、次生代謝物生物合成過程(secondary metabolite biosynthetic process)、麥角固醇生物合成的過程(ergosterol biosynthetic process)等；由伊曲康唑刺激引起下調(diào)的基因被富集到的生物過程包括細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)(cellular calcium ion homeostasis)、跨膜運(yùn)輸(transmembrane transport)、轉(zhuǎn)錄(transcription,DNA-templated).由此可知，在伊曲康唑刺激下，ΔAfssn3菌株中固醇合成通路的激活是最顯著的.

注：(a)為基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)的生物過程，(b)為基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)的生物過程； 橫坐標(biāo)為每個(gè)條目對(duì)應(yīng)的-log10P value，縱坐標(biāo)為GO條目名稱. 圖1 Gene Ontology富集分析條形圖Fig.1 Bar chart of Gene Ontology enrichment analysis

2.3 KEGG富集分析

通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/)富集分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，類固醇生物合成(Steroid biosynthesis)、氨基苯甲酸酯降解(Aminobenzoate degradation)、氨基糖和核苷酸糖的代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、色氨酸代謝(Tryptophan metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(Glycine,serine and threonine metabolism)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)等通路中的基因表達(dá)顯著上升，其中類固醇生物合成(Steroid biosynthesis)通路中的基因表達(dá)仍是上升最明顯的.

注：橫坐標(biāo)為每個(gè)條目對(duì)應(yīng)的-log10P value，縱坐標(biāo)為KEGG通路條目名稱. 圖2 KEGG富集分析中上調(diào)的通路Fig.2 Up-regulated pathways in KEGG enrichment analysis

2.4 類固醇生物合成通路相關(guān)基因的差異表達(dá)

根據(jù)上述KEGG富集分析中上調(diào)的通路，找到類固醇生物合成通路的相關(guān)基因，并將其富集到通路圖(圖3)中，其中表達(dá)上調(diào)的基因包括cyp51/erg11(1.14.13.70/Cyp51G1)、tm7sf2/erg24b(1.3.1.70/FK)、meso1/erg25(1.14.13.72)、smt1/erg6、sc5dl/erg3(1.14.19.20/STE1)，其分別上調(diào)2.79倍、2.37倍、3.26倍、3.30倍、2.43倍；表達(dá)下調(diào)的基因有soat(2.3.1.26)，其下調(diào)2.47倍.

注：有深色/淺色框的基因?qū)儆诓町惐磉_(dá)基因，其中有深灰色框的基因(如ERG6)為上調(diào)基因， 有淺灰色框的基因(如2.3.1.26)為下調(diào)基因. 圖3 類固醇生物合成通路中上下調(diào)基因富集分析通路圖Fig.3 Diagram of enrichment analysis pathways for up and down-regulation genes in steroid biosynthesis pathway

3 討 論

目前，煙曲霉對(duì)三唑類藥物的耐藥機(jī)制大部分集中在3個(gè)方面[11]：一是改變藥物主要靶標(biāo)，如細(xì)胞膜麥角固醇合成途徑中的細(xì)胞色素P450酶系的羊毛甾醇14α-去甲基酶Erg11A/Cyp51A亞基，從而導(dǎo)致唑類藥物的脫靶耐藥，或通過Erg11/Cyp51全酶A和B兩亞基基因啟動(dòng)子區(qū)域的各種突變，引起該基因表達(dá)量上調(diào)，導(dǎo)致藥靶過量表達(dá)而產(chǎn)生耐藥.二是增加真菌外排泵的表達(dá)和提高外排泵的活力.藥物外排泵有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-bindingcassette transporter，ABCT)和主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)兩類，目前認(rèn)為屬于ABC超家族的藥物外排泵(drug efflux pumps)的高表達(dá)是引起真菌耐藥的最主要途徑.三是生物膜耐藥.真菌生物膜的形成機(jī)制較復(fù)雜，同細(xì)菌生物膜一樣，能夠阻止抗真菌藥物向細(xì)胞內(nèi)滲透，從而導(dǎo)致藥物耐受.

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究主要通過分析經(jīng)伊曲康唑處理后Afssn3基因缺失菌株的差異表達(dá)基因和相關(guān)通路的改變，探究煙曲霉Afsnn3基因缺失后的耐藥機(jī)制.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，Afssn3缺失菌株主要有兩大類基因的改變：膜整合蛋白和細(xì)胞外蛋白基因，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、藥物外排泵和各種細(xì)胞外蛋白；代謝相關(guān)基因，如水解酶激酶、糖酵解相關(guān)酶等各種代謝酶.通過GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，ergosterol biosynthetic process(麥角甾醇生物合成過程)明顯上調(diào)，其中cyp51A(erg11A)、erg24B、meso1(erg25)、smt1(erg6)、sc5dl(erg3)表現(xiàn)為上調(diào)，這些都是參與類固醇生物合成通路的特異性基因.本文還分析了其他諸如外排泵、熱休克蛋白、鈣信號(hào)通路等耐藥機(jī)制的相關(guān)基因[7,12]，其中只有外排泵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的mdr4基因上調(diào)2.61倍.由此推測(cè)，Afssn3缺失后的耐藥機(jī)制可能是通過上調(diào)cyp51A藥靶基因的表達(dá)量增加藥靶的含量，從而產(chǎn)生耐藥性，還可能是通過上調(diào)外排泵的活性導(dǎo)致耐藥.本文的研究結(jié)果為煙曲霉耐藥分子調(diào)控機(jī)制的研究提供了新的線索和依據(jù).