汪千慧，劉夢靈，覃燕梅，張文濤，趙俊杰，顧佳黎，孫來玉

(湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

0 引 言

惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的扁桃酸消旋酶能催化扁桃酸及其衍生物對應(yīng)異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，在構(gòu)建動態(tài)動力學(xué)過程中具有重要作用[1].筆者在本課題的前期研究中，發(fā)現(xiàn)扁桃酸消旋酶的熱穩(wěn)定性較差，在60 ℃下的半衰期只有5.1 min，這與其在高溫下α-螺旋含量降低、氫鍵數(shù)量減少密切相關(guān)[2].工業(yè)生產(chǎn)要求酶制劑具有良好的熱穩(wěn)定性.因此，增強該消旋酶的穩(wěn)定性，對進一步擴大其在工業(yè)中的應(yīng)用具有重要意義.

酶和微生物的固定化技術(shù)是改善酶制劑穩(wěn)定性的有效技術(shù)方法，其固定化可實現(xiàn)酶或微生物的重復(fù)利用[3-4].Wrzosek 等將扁桃酸消旋酶分別共價偶聯(lián)于商業(yè)化介質(zhì)Eupergit ? CM和CNBr- activated Sepharose 4 Fast Flow后，消旋酶的操作穩(wěn)定性得到了有效提高.但共價偶聯(lián)吸附具有非特異性，其固定化酶回收效率較低[5].而固定化金屬螯合層析技術(shù)，主要是利用目的蛋白上的六聚組氨酸(His)標簽結(jié)構(gòu)與金屬離子之間的親和作用力，以粗酶液為料液，一步完成酶的純化和固定化，以實現(xiàn)酶的原位純化固定化，從而有效降低在純化和固定化過程中造成的酶活損失[6-7].其中，螯合鎳離子的層析柱被廣泛應(yīng)用于帶His標簽的蛋白純化[8-9].本文以自制的鎳離子螯合的瓊脂糖微球為載體，制備固定化扁桃酸消旋酶，對消旋酶給酶量進行優(yōu)化，并對固定化酶的性能進行比較研究.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試劑：Bestarose CL-6B 微球購于博格隆(上海)生物技術(shù)有限公司；Ni2+蛋白純化柱 (HisTrapTM HP) 和脫鹽柱 (HiTrapTM Desalting)購于 GE Healthcare；二甲基亞砜、環(huán)氧氯丙烷、NaOH、亞氨基二乙酸、Na2CO3、NaBH4、NiSO4、Tris、MgCl2、咪唑、S-扁桃酸等均為國產(chǎn)化學(xué)純或分析純，購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；高效氣相色譜所用的流動相(異丙醇、正己烷和三氟乙酸)為色譜純(Tedia 產(chǎn)品).

儀器：水浴搖床(Sanhao CMB100)、超聲破碎儀(JY92-Ⅱ)、垂直電泳系列(Tanon EPS 300)、高速冷凍離心機(Allegra X-15R)、AKTA 蛋白純化儀(AKTAPrime 11-0031-18)、高效液相色譜儀(Agilent 1100)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA).

1.2 鎳螯合瓊脂糖微球的制備

取適量抽干的Sepharose微球，加入一定量的二甲基亞砜、環(huán)氧氯丙烷、H2O和NaOH， 在50 ℃、150 rpm下反應(yīng)2 h，用去離子水洗滌；加入亞氨基二乙酸、Na2CO3和NaBH4溶液，在60 ℃、150 rpm下反應(yīng)24 h，用去離子水洗滌；加入NiSO4溶液，在25 ℃、150 rpm下反應(yīng)3 h，用去離子水洗滌，得到鎳螯合瓊脂糖微球.

1.3 鎳螯合微球?qū)Ρ馓宜嵯傅奈教禺愋?/h3>

取適量含有扁桃酸消旋酶重組基因的大腸桿菌，加入0.1 M Tris-HCl緩沖液(pH 7.2，含3.3 mM MgCl2)，超聲破碎后離心，取少量沉淀加入到Tris-HCl緩沖液(破胞沉淀)中，用于蛋白電泳；取上清(粗酶液)，加入鎳螯合微球，冰水浴振蕩30 min后靜置，待微球沉淀后，取適量上清(吸附后的上清液)用于蛋白電泳，將剩余的上清液及微球抽濾，用去離子水洗滌，得到固定化扁桃酸消旋酶；取適量固定化酶，加入含0.5 M咪唑的Tris-HCl緩沖液，冰水浴振蕩10 min，取上清液(脫吸后溶液)用于蛋白電泳.

1.4 消旋酶給酶量對固定化效果的影響

將含有重組扁桃酸消旋酶的粗酶液，用Ni2+離子親、層析柱(HisTrapTMHP)和脫鹽柱(HisTrapTMDesalting)進行蛋白純化，獲得純酶液(游離酶).其純化流程參照Novagen protocols.分別取10 mg鎳螯合微球置于5根4 mL EP管中，分別加入1、1.5、2、2.5、3 mL的純酶液，冰浴振蕩20 min后，用5 mL規(guī)格的重力注射器過濾，收集濾液(殘液).

采用Bio-Rad法(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)測定加入的純酶液(C0)和殘液(C)的蛋白濃度，根據(jù)吸附前后的蛋白量變化，確定微球的蛋白載量.其蛋白載量(mg/g濕球)的計算公式為：

蛋白載量=(C0-C)×V÷m，

(1)

式中，C0為加入的純酶液的蛋白濃度(mg/mL)，C為殘液的蛋白濃度(mg/mL)，V為加入的酶液體積(mL)，m為微球質(zhì)量(g).

將偶聯(lián)效率、相對活力和活力回收作為固定化效率的3個指標，計算公式為：

偶聯(lián)效率=(加入的純酶液的總酶活-殘液的總酶活)/加入的純酶液的總酶活×100%，

(2)

相對活力=固定化酶的總酶活/(加入的純酶液的總酶活-殘液的總酶活)×100%，

(3)

活力回收=固定化酶的總酶活/加入的純酶液的總酶活×100%.

(4)

1.5 酶活的測定

酶單位的定義：在特定的反應(yīng)條件下，每l min轉(zhuǎn)化的S-扁桃酸，產(chǎn)生的1 μmol R-扁桃酸所需的酶量為l單位消旋酶活力.

游離酶的酶活測定：取500 μL緩沖液(0.1 M，含3.3 mM MgCl2、10 mM S-扁桃酸)，加入5～10 μL酶液，在30 ℃、200 rpm下反應(yīng)20 min，加酸終止反應(yīng).在乙酸乙酯萃取后進行高效液相色譜(HPLC).

固定化酶酶活測定：取20 mL緩沖液(0.1 M，含3.3 mM MgCl2、10 mM S-扁桃酸)，加入約4 mg固定化酶，在30 ℃、200 rpm下反應(yīng)20 min，加酸終止反應(yīng)，在乙酸乙酯萃取后進行高效液相色譜(HPLC).

1.6 固定化酶和游離酶最適反應(yīng)條件的測定

分別在不同的溫度(20、25、30、35、40、45、50 ℃)、pH(5.6、6.4、7.1、7.5、8.0、8.5、8.8、9.1、9.4、9.8、10.2)和底物S-扁桃酸濃度(5、10、20、40、60、80、100 mM)條件下，測定扁桃酸消旋酶游離酶和固定化酶的酶活，研究游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)條件.其中，pH 5.6采用乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH 6.4～8.0采用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH 8.5～8.9采用Tris-鹽酸緩沖液，pH 9.0～10.2采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液.

游離酶和固定化酶的相對酶活(%)：在同組實驗中，最高酶活定為100%，其余游離酶或固定化酶的酶活與其比值定為相對酶活.

1.7 固定化酶與游離酶熱穩(wěn)定性的測定

將扁桃酸消旋酶游離酶和固定化酶于60 ℃溫浴一定時間(1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40 min)后，測定其酶活，探討游離酶和固定化酶在60 ℃條件下的半衰期.

1.8 固定化酶的重復(fù)利用性

取10 mL緩沖液(0.1 M，含3.3 mM MgCl2、10 mM S-扁桃酸)于重力注射器中，加入5.6 mg固定化酶，在30 ℃、200 rpm條件下反應(yīng)20 min；過濾得到反應(yīng)液，加酸調(diào)節(jié)pH至2.0左右，用乙酸乙酯萃取后進行高效液相色譜(HPLC)，再計算酶活；用去離子水多次洗滌重力注射器中的微球，再次加入10 mL含S-扁桃酸的緩沖液進行反應(yīng)；重復(fù)30次，比較不同批次的酶活性，探討固定化酶的重復(fù)利用性.

1.9 高效液相色譜(HPLC)

液相色譜采用 AD-H(Daicel，250 mm×4.6 mm)手性柱，用紫外/可變波長檢測器進行檢測(SPD-20A，Shimadzu)，檢測波長為254 nm，流動性為正己烷和異丙醇(含0.1%三氟乙酸)，體積比為92∶8，流速為1 mL/min.

1.10 SDS-PAGE分析

以膠濃度為15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用Laemm li方法進行，用考馬斯亮藍染色[10].

2 結(jié)果與討論

圖1 扁桃酸消旋酶的電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of mandelae racemase

2.1 鎳螯合金屬微球的吸附特異性

將制備得到的鎳螯合金屬微球從扁桃酸消旋酶粗酶液中直接提取消旋酶，結(jié)果如圖1所示.目標蛋白重組扁桃酸消旋酶(含組氨酸標簽)分子量的大小約為38 kDa，可見扁桃酸消旋酶被成功表達，部分以包涵體形式存在.比較粗酶液與吸附后上清液的電泳條帶，可見在吸附后的上清液中幾乎不存在扁桃酸消旋酶，表明扁桃酸消旋酶已全部被吸附到鎳螯合金屬微球上.觀察脫吸后溶液的電泳條帶，只見在目標蛋白處出現(xiàn)單一的蛋白條帶.由此表明，螯合微球具有良好的特異性吸附能力，可以直接從粗酶液中吸附純化及固定化目標蛋白.

2.2 給酶量對固定化效果的影響

以蛋白載量、偶聯(lián)效率、相對活力和活力回收為評價固定化效果的指標，研究制備固定化酶的最適給酶量.從圖2～3可以看出，隨著給酶量從7 mg/g微球增加至24 mg/g微球，蛋白載量不斷提高.當給酶量從7 mg/g微球增至12 mg/g微球時，偶聯(lián)效率從36.6%增至39%，但隨著給酶量的再增加，偶聯(lián)效率逐漸降低至25.2%.其原因是隨著給酶量的增加，固定化載體的結(jié)合位點趨于飽和.從圖2～4可以看出，隨著蛋白量的增加，固定化酶的相對活力緩慢下降，并逐漸趨于平緩.當給酶量從7 mg/g微球增至15 mg/g微球時，活力回收從26.6%增至32.4%，但隨著給酶量的再增加，活力回收逐漸降至21.9%.這是因為載體上Ni2+位點的數(shù)量是不變的，隨著給酶量的增加，Ni2+位點逐漸飽和，當位點全部飽和后，繼續(xù)增加酶量，活力回收反而下降.李黎等報道，活力回收隨著給酶量的增加而下降，這與其采用的固定化介質(zhì)和目標蛋白與本研究不同有關(guān)[11].綜合考慮，最終選擇12 mg蛋白/g微球的蛋白加入量用于固定化酶的制備.

圖2 給酶量對偶聯(lián)效率和蛋白載量的影響Fig.2 Effects of offered proteins on the immobilization efficiency and protein loading

圖3 給酶量對相對活力和活力回收的影響Fig.3 Effects of offered proteins on the activity retention and activity recovery

2.3 固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)條件

研究固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)條件(溫度、pH、底物濃度)，結(jié)果如圖4～6所示.圖4所示，固定化酶和游離酶的最適溫度均為30 ℃.在考察溫度范圍(20～50 ℃)內(nèi)，固定化酶的相對活性比游離酶高，說明與游離酶相比，固定化酶的溫度穩(wěn)定性得到了改善.其原因可能是固定化過程穩(wěn)定了酶分子的構(gòu)象，從而提高了酶的變性溫度；也可能是固定化介質(zhì)的保護作用，使得酶在高溫區(qū)更不易失活.劉琳琳在利用Cu2+金屬螯合載體固定化木瓜蛋白酶的研究中也觀察到這一現(xiàn)象[12].

分別測定固定化酶和游離酶在不同pH值下的酶活力，結(jié)果如圖5所示.固定化酶和游離酶的最適pH值均為8.0，相比游離酶，固定化酶能在相當寬的pH范圍內(nèi)保持較高的酶活.由此表明，固定化酶pH的耐受力優(yōu)于游離酶.其原因可能是在固定化載體活化后，其表面帶有的羧基緩沖了溶液中部分陽離子，如H+，從而使其表現(xiàn)出更強的pH適應(yīng)性.這在固定化?；浮⒛竟系鞍酌傅鹊难芯恐卸加袌蟮繹12-13].吳洋等報道，固定化載體表面的金屬離子可使溶液中的陰離子吸附于載體表面，并可抵消部分環(huán)境影響，使固定化酶表現(xiàn)出較大的活力[14].

圖4 溫度對游離酶和固定化酶酶活的影響Fig.4 Effects of temperature on the activity of free enzyme and immobilized enzyme

圖5 pH對游離酶和固定化酶酶活的影響Fig.5 Effects of pH on the activity of free enzyme and immobilized enzyme

底物濃度對固定化酶和游離酶活性的影響如圖4所示.由圖4可以看出，在S-扁桃酸濃度為10～100 mM范圍內(nèi)，隨著底物濃度的升高，游離酶和固定化酶的活性先升高后下降.固定化酶和游離酶的最適底物濃度分別為60 mM和80 mM，固定化酶的最適底物濃度比游離酶高10 mM，說明固定化酶的底物耐受性高.同時，固定化酶對高濃度底物的催化活性明顯高于游離酶，當?shù)孜餄舛葹?00 mM時，固定化酶仍能保持87.6 %的相對活性.

2.4 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性

比較固定化酶和游離酶在60 ℃下的穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示.固定化酶在60 ℃下的半衰期(T601/2)為26.6 min，游離酶的T601/2為4.6 min，固定化酶的T601/2是游離酶的5.8倍左右，表明固定化酶的溫度穩(wěn)定性得到提高.吳洋等對固定化腈水解酶的研究也發(fā)現(xiàn)，固定化酶的熱穩(wěn)定性高于游離酶，在50 ℃下保持30 min，游離酶的活性損失達75%以上，而固定化酶的酶活僅損失20%左右[14].

表1 游離酶和固定化酶在60 ℃下的半衰期(T601/2)

2.5 固定化酶的重復(fù)利用性

由圖7可見，在重復(fù)使用30批次之后，固定化酶仍能保持約60%的相對活性.這與報道的金屬螯合固定化脂肪酶、苯甲酰甲酸脫羧酶的性能相當[7,15].

圖6 底物濃度對游離酶和固定化酶酶活的影響Fig.6 Effects of substrate concentration on the activity of free enzyme and immobilized enzyme

圖7 不同使用批次的固定化酶的相對活性Fig.7 The relative activity of immobilized enzyme with different recycled number

3 結(jié) 論

本研究以鎳螯合微球為介質(zhì)，制備固定化扁桃酸消旋酶.研究結(jié)果表明：鎳螯合微球?qū)ο肝降膶Ｒ恍阅芎?，當給酶量為12 mg/g載體時，固定化效果最佳；與游離酶相比，固定化酶的溫度穩(wěn)定性和底物濃度的耐受性都得到了明顯提高；固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性，循環(huán)使用30批次后，固定化酶仍能保持約60%的相對活性，表明消旋酶的固定化在工業(yè)方面具有良好的應(yīng)用前景