趙欣杰，司富春，張漂，劉子提

河南中醫(yī)藥大學(xué)/河南省中醫(yī)方證信號(hào)傳導(dǎo)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省中醫(yī)方證信號(hào)傳導(dǎo)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046

卵巢癌作為嚴(yán)重威脅女性生殖健康的惡性腫瘤，因缺乏早期癥狀與體征，患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已多處于中晚期，病死率高，5年生存率為20%～25%[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)共有295 414例新發(fā)卵巢癌確診和184 799例死亡病例[2]，對(duì)女性健康產(chǎn)生了巨大威脅，對(duì)卵巢癌的治療與防控應(yīng)該引起更高的重視。當(dāng)歸芍藥散源于《金匱要略》，臨床用于治療盆腔炎性疾病[3]、卵巢癌[4]、卵巢囊腫[5]、痛經(jīng)[6]等婦科疾患，效果顯著。結(jié)合藥理學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)歸對(duì)腫瘤細(xì)胞增生的抑制作用是通過抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用實(shí)現(xiàn)的[7]；赤芍除常見中藥功效之外，還有保肝、抗腫瘤等多種藥理作用，通過免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、周期凋亡基因表達(dá)調(diào)控等途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[8]；白術(shù)通過下調(diào)卵巢癌細(xì)胞CDK1表達(dá)阻止細(xì)胞增殖，抑制腫瘤的進(jìn)一步進(jìn)展[9]；茯苓、澤瀉等通過對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)達(dá)到抑制腫瘤進(jìn)展的效果[10-11]；川芎在腫瘤的治療作用中集中表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖和基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。成分多、靶點(diǎn)多、通路多是中藥復(fù)方治療疾病的突出特點(diǎn)，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究當(dāng)歸芍藥散對(duì)卵巢癌的作用機(jī)制，以期為臨床治療提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 獲取藥物活性成分和對(duì)應(yīng)靶標(biāo)在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索“當(dāng)歸”“赤芍”“白術(shù)”“茯苓”“澤瀉”“川芎”的主要活性成分，并選定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18的活性成分[13]，查詢獲取相應(yīng)候選靶標(biāo)。

1.2 分析預(yù)測靶標(biāo)對(duì)應(yīng)基因以“人”為限定種類，對(duì)當(dāng)歸芍藥散藥物候選靶標(biāo)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)，獲取對(duì)應(yīng)基因和UNIPROTKB。

1.3 獲取卵巢癌靶標(biāo)基因及藥物潛在作用靶標(biāo)利用Genecards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)檢索“ovarian cancer”，獲取疾病基因，并對(duì)比復(fù)方靶標(biāo)，獲取重合基因作為潛在作用靶標(biāo)。

1.4 構(gòu)建成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖利用Cytoscape3.8.0軟件對(duì)藥物活性成分及作用靶標(biāo)進(jìn)行分析，繪制網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.5 核心靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建限定STRING數(shù)據(jù)庫種類為“人類物種(Homo sapiens)”，獲取潛在靶標(biāo)蛋白互作關(guān)系，利用繪圖軟件做出關(guān)系圖。

1.6 富集分析基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析結(jié)果從DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)獲取，利用Rstudio對(duì)P<0.05的前20個(gè)通路進(jìn)行高級(jí)氣泡圖的繪制。

1.7 繪制成分-靶標(biāo)-通路圖將所得可能與卵巢癌相關(guān)的通路、作用靶標(biāo)和活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，繪制網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.8 預(yù)后生存分析對(duì)預(yù)測核心基因進(jìn)行Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線識(shí)別，獲取預(yù)后信息，并通過Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)網(wǎng)站對(duì)卵巢癌和正常人基因水平進(jìn)行深入鑒定。

1.9 分子對(duì)接將PPI網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的有效活性成分結(jié)構(gòu)保存為mol2格式，并在PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/)下載靶蛋白數(shù)據(jù)文件，借助Autodock Tools軟件對(duì)其進(jìn)行去水、加氫、計(jì)算電荷并進(jìn)行分子對(duì)接分析。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸芍藥散候選活性成分利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，獲取復(fù)方中單味藥活性成分共計(jì)568個(gè)，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為限定條件，挑選符合條件的活性成分70個(gè)，見圖1。

圖1 當(dāng)歸芍藥散活性成分

2.2 候選靶標(biāo)預(yù)測活性成分對(duì)比Uniprot數(shù)據(jù)庫，獲取藥物作用靶標(biāo)，并將其對(duì)比疾病基因，選取可能與卵巢癌相關(guān)作用靶標(biāo)72個(gè)，見表1。

表1 當(dāng)歸芍藥散潛在作用靶標(biāo)信息

2.3 活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。其中含節(jié)點(diǎn)101個(gè)(活性成分30個(gè)，作用靶標(biāo)71個(gè))，邊181條，紅色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，紫色代表靶標(biāo)，對(duì)應(yīng)關(guān)系用灰色線條展現(xiàn)。由圖2可得，活性成分與靶標(biāo)并非單純一一對(duì)應(yīng)，而是復(fù)雜多樣的對(duì)應(yīng)關(guān)系，這說明當(dāng)歸芍藥散治療卵巢癌存在多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖2 當(dāng)歸芍藥散成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 核心基因互作分析利用STRING數(shù)據(jù)庫獲取核心靶標(biāo)，并使用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。其中包含77個(gè)節(jié)點(diǎn)和952條邊。節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，則表示連接度越高。故而腫瘤抑制因子(TP53)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、前列腺素G /H合酶2(PTGS2)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、孕激素受體(PGR)7個(gè)靶標(biāo)可作為核心靶標(biāo)。

圖3 當(dāng)歸芍藥散核心靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析在DAVID數(shù)據(jù)庫獲取GO和KEGG富集結(jié)果，篩選P<0.05的通路和生物過程進(jìn)行進(jìn)一步分析，P值越小，說明該通路與當(dāng)歸芍藥散治療卵巢癌關(guān)系越密切(圖4、圖5、圖6中，橫坐標(biāo)是Gene Ratio，縱坐標(biāo)是富集出來的通路，點(diǎn)越大表示富集基因越多，顏色越深表示P值越小，關(guān)系越密切)。GO富集分析中細(xì)胞組分(cellular component，CC)富集化比例較大體現(xiàn)在胞質(zhì)(Cytosol)、胞核(Nucleus)等(圖4)，分子功能(molecular function，MF)主要為酶結(jié)合(Enzyme binding)(圖5)，生物過程(biological process，BP)的是藥物反應(yīng)(Response to drug)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、雌二醇反應(yīng)(Response to estradiol)等(圖6)。KEGG通路富集結(jié)果(圖7)顯示乙型肝炎通路、腫瘤通路等通路與當(dāng)歸芍藥散治療卵巢癌的密切相關(guān)。

圖4 當(dāng)歸芍藥散活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的CC分析

圖5 當(dāng)歸芍藥散活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的MF分析

圖6 當(dāng)歸芍藥散活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的BP分析

圖7 當(dāng)歸芍藥散活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的BP分析

2.6 分析構(gòu)建成分-靶標(biāo)-通路關(guān)系在Cytoscape3.8.0軟件中繪制如圖8所示成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并使用藍(lán)色三角形、紅色圓形、綠色六邊形分別代表活性成分、靶標(biāo)基因和相關(guān)通路。黃芩素(baicalein)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、楊梅酮(Myricanone)、鞣花酸(ellagic acid)等是藥物作用的主要成分，靶標(biāo)基因主要是TP53、VEGFA、RELA、JUN等，關(guān)聯(lián)到磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase-Akt signal transduction pathway/protein kinase B，PI3K/Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等信號(hào)通路。

圖8 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 基因生存分析將采用Cytoscape3.8.0軟件篩選出的VEGFA、TP53、PTGS2、RELA、JUN、MMP9、PGR等7個(gè)核心基因?qū)氲終aplan-Meier Plotter中，結(jié)果顯示：上述7個(gè)基因的表達(dá)與卵巢癌患者的生存率呈負(fù)相關(guān)，提示卵巢癌患者預(yù)后可能與VEGFA等基因表達(dá)水平密切相關(guān)(圖9)。為明確卵巢癌與正常人基因表達(dá)水平，利用GEPIA網(wǎng)站分析7個(gè)與預(yù)后不良靶標(biāo)基因，發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因具有顯著的表達(dá)水平，見圖10。

圖9 基因表達(dá)與患者預(yù)后的生存曲線(P<0.05)

注：紅色表示腫瘤組織，灰色表示正常組織

2.8 分子對(duì)接結(jié)果選取度值靠前的黃芩素(baicalein)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、楊梅酮(Myricanone)、鞣花酸(ellagic acid)等5個(gè)活性成分與排名靠前的TP53、VEGFA、RELA、JUN進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。如結(jié)合能<0，則配體和受體蛋白可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能<-5.0 kcal·mol-1，表明結(jié)合活性良好[14]，見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、楊梅酮、鞣花酸均與TP53有較好的結(jié)合能力，VEGFA與楊梅酮不具備自發(fā)結(jié)合能力，RELA和黃芩素、鞣花酸結(jié)合能力較好，JUN則僅與β-谷甾醇有較好結(jié)合能力。隨后，利用 PyMOL 軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白和成分對(duì)接進(jìn)行可視化分析，直接展現(xiàn)其構(gòu)象關(guān)系(以黃芩素為例)，見圖11。

圖11 黃芩素與核心標(biāo)點(diǎn)基因的分子對(duì)接

表2 成分與靶點(diǎn)結(jié)合能

3 討論

“婦人腹中諸疾痛，當(dāng)歸芍藥散主之[15]?！迸R床對(duì)當(dāng)歸芍藥散的應(yīng)用很多，集中表現(xiàn)在婦科領(lǐng)域。方中藥物所含主要成分當(dāng)歸多糖[16]、赤芍總苷[17]、川芎揮發(fā)油[18]、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ[19]、茯苓多糖[20]、澤瀉醇B[21]等都可以通過不同途徑抑制腫瘤細(xì)胞生長。劉剛[22]通過文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸芍藥散加味治療卵巢癌的總體有效率達(dá)到89.76%。高升等[23]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸芍藥散可以降低腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，提高生存質(zhì)量。此外，復(fù)方藥物還可以通過免疫調(diào)節(jié)“下丘腦-垂體-卵巢”軸治療婦科疾病。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)方病進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性研究，進(jìn)一步明確當(dāng)歸芍藥散的作用機(jī)制，以期為臨床治療提供借鑒。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸芍藥散發(fā)揮作用的主要成分是黃芩素、過氧麥角甾醇、鞣花酸。其中，黃芩素可通過激活Caspases和Bcl-2家族蛋白誘導(dǎo)卵巢癌HO-8910細(xì)胞凋亡[24]，過氧麥角甾醇會(huì)隨著藥物劑量的增加影響卵巢癌細(xì)胞A2780S早期凋亡率[25]，鞣花酸經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有較廣泛的抗腫瘤作用，可通過降低體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制腫瘤生長水平[26]。

作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示，腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄因子p65、MMP9、孕激素受體等是當(dāng)歸芍藥散作用于卵巢癌的核心靶標(biāo)。其中腫瘤抑制因子基因上調(diào)后可抑制卵巢癌細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[27]，NF-κB/p65可能通過增強(qiáng)APR3的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展[28]；MMP9通過誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)變化，使細(xì)胞逐漸分離、擴(kuò)散，從而影響卵巢癌細(xì)胞膜MUC16蛋白表達(dá)[29]；孕激素可能通過細(xì)胞周期進(jìn)程，從而影響卵巢癌SKOV3、HO-8910細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力[30]。預(yù)后分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子、MMP9、孕激素受體與預(yù)后關(guān)系十分密切，之后研究可著重分析。

經(jīng)過文獻(xiàn)檢索和KEGG通路富集分析，當(dāng)歸芍藥散治療卵巢癌主要涉及Pathways in cancer、Hepatitis B、PI3K-Akt、MAPK、VEGF等通路。焦曉路等[31]在研究中發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號(hào)通路與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展以及化療耐藥程度都有明顯相關(guān)性，可以介導(dǎo)細(xì)胞遷移、侵襲，抑制自噬凋亡，在臨床上可根據(jù)這一表現(xiàn)將其作為治療靶點(diǎn)；MAPK信號(hào)通路受到PFKFB3對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝影響，從而調(diào)控促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖遷移，可將阻斷MAPK信號(hào)通路作為卵巢癌生物治療的研究方向[32]；通過低劑量分次照射抑制VEGF表達(dá)可影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[33]。

最后，本研究通過分子對(duì)接技術(shù)對(duì)排名前5位的活性成分和靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示黃芩素、鞣花酸與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白結(jié)合時(shí)的結(jié)合能均小于 5.0 kcal·mol-1，提示其有良好的結(jié)合活性，說明當(dāng)歸芍藥散對(duì)卵巢癌發(fā)揮作用時(shí)主要通過黃芩素、鞣花酸等對(duì)靶點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。

綜上，當(dāng)歸芍藥散主要通過黃芩素、鞣花酸等活性成分實(shí)現(xiàn)對(duì)TP53、MMP9、PGR等細(xì)胞基因的表達(dá)，從而調(diào)控PI3K-Akt、MAPK、VEGF等通路，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖遷移過程。由此可見，當(dāng)歸芍藥散治療卵巢癌具有多成分、多靶標(biāo)、多通路的特點(diǎn)，且預(yù)后效果良好。本研究針對(duì)藥物活性成分、靶標(biāo)基因進(jìn)行了成方治療卵巢癌作用機(jī)制的探討，但未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，下一步應(yīng)從多方面展開實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為臨床提供指導(dǎo)。