黃 堅，劉韻佳，楊曉農(nóng)，李 妍*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)教學(xué)動物醫(yī)院，成都 610041)

貓皰疹病毒1型(feline herpesvirus-1，F(xiàn)HV-1)為水痘病毒屬的雙鏈DNA包膜病毒，是引起貓上呼吸道感染(如鼻炎和結(jié)膜炎)的主要病原之一。多個血清學(xué)的調(diào)查結(jié)果表明，已免疫和未免疫貓只的FHV-1 抗體陽性率為10.0%～40.9%，提示部分飼養(yǎng)或流浪貓群仍存在FHV-1傳播和持續(xù)流行的風(fēng)險。在不同的調(diào)查報告中，F(xiàn)HV-1的檢出率(8.0%～28.3%)存在地區(qū)和群體差異性，這可能與檢測方法、樣本中病毒分布和載量以及病毒變異等因素有關(guān)，對現(xiàn)有病原檢測方法的即時性和靈敏度提出了挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的商品化FHV-1檢測方法主要基于實時熒光PCR原理，可靶向胸苷激酶(TK)、糖蛋白B(gB)或糖蛋白D(gD)等基因進(jìn)行特異性檢測，但需要配備特殊的檢測設(shè)備，且較為耗時，不便于現(xiàn)場快速檢測。因此，建立快速靈敏的可視化檢測方法十分必要。

2018年，Doudna的研究團(tuán)隊首次將CRISPR-Cas12a核酸酶的切割反應(yīng)與重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)技術(shù)相結(jié)合，建立了DNA核酸快速檢測的方法，并命名為DNA內(nèi)切酶靶向的CRISPR反式報告檢測系統(tǒng)(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter，DETECTR)。其工作原理為通過體外合成的crRNA引導(dǎo)CRISPR-Cas12a特異性識別經(jīng)RPA擴(kuò)增的目標(biāo)DNA序列，并利用Cas12a核酸酶的附帶切割活性(反式切割)降解反應(yīng)體系中的ssDNA報告探針，從而產(chǎn)生可在側(cè)流層析試紙條(lateral flow dipstick，LFD)上顯示的標(biāo)記信號，增強(qiáng)了結(jié)果的可視化。目前，尚無針對FHV-1的RPA-Cas12a-LFD檢測方法，因此本研究將結(jié)合RPA擴(kuò)增、Cas12a反式切割反應(yīng)和LFD顯示技術(shù)建立針對FHV-1基因的快速可視化分子檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

從西南民族大學(xué)教學(xué)動物醫(yī)院采集患有典型上呼吸道臨床癥狀的貓眼鼻拭子20份，于-80 ℃保存。另外，貓皰疹病毒1型(FHV-1)、貓杯狀病毒(FCV)、貓冠狀病毒(FCoV)、貓諾如病毒(FNoV)、貓星狀病毒(FAstV)、貓細(xì)小病毒(FPV)以及貓大腸桿菌()和肺炎克雷伯桿菌()和貓支原體(FM)的陽性樣本分別采集自1家動物醫(yī)院和2家貓舍，所有核酸樣本均由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室制備、鑒定和保存。

1.2 主要試劑及儀器

RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqII、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T克隆載體和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物有限公司)、2×Mastermix(蓉為基因生物科技有限公司)；EnGenLbaCas12a核酸酶、HiScribe T7高效RNA合成試劑盒、DNase Ⅰ(無RNase)、NEBuffer2.1(10×)、Monarch RNA 純化試劑盒(NEB公司，美國)、Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)(碧云天公司)；Gel Extraction Kit(Omega公司，美國)；TIANamp DNA Extraction kit、pGM-T Fast Ligation Kit、TIANpure Midi Plasmid Kit[天根生化科技(北京)有限生物公司]、TwistAmpBasic Kit(TwistDx公司，英國)、Milenia HybriDetect 側(cè)流層析試紙條、Milenia GenLine Universalmodul Assay Buffer(Milenia-biotec公司，德國)；凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc MP System(Bio-Rad公司，美國)；超微量核酸蛋白測定儀和熒光定量基因擴(kuò)增儀(ThermoFisher Scientiifc公司，美國)；電熱恒溫水浴鍋(Bluepard)。

1.3 樣本核酸提取、FHV-1質(zhì)粒構(gòu)建和TB Green qPCR方法的建立

使用試劑盒分別提取臨床樣本及保存的貓病原陽性樣本中的DNA或RNA，并使用試劑盒對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將所有DNA和cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。對疫苗樣本中擴(kuò)增得到的FHV-1基因片段進(jìn)行膠回收，純化產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆和質(zhì)粒提取，將測序正確的質(zhì)粒于-20 ℃保存。建立并優(yōu)化FHV-1基因的TB Green qPCR的反應(yīng)體系，對質(zhì)粒模板進(jìn)行梯度稀釋后擴(kuò)增，構(gòu)建熔解曲線、擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 引物設(shè)計和合成

針對FHV-1基因的crRNA寡核苷酸(forward：5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3′；reverse：5′-TGTTATTGTGGATAGTCTGGAATGATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGT-GAGTCGTATTAATTTC-3′，68 bp)、RPA引物(forward：5′-CCTATATCACCGCCCACTATCAAGCAAGATTTGCC-3′；reverse：5′-CTATCTATGATTAGGGTCACGTCGGGGTGTTCC-3′，133 bp)、TB Green qPCR(forward：5′-TCTCGCCTCTCTGGTCTGTTTCC-3′，reverse：5′-CAGGAGGTTCTCGTGGAAGTGTTG-3′，104 bp)引物均由本實驗室設(shè)計。另外合成ssDNA報告探針(5′-6-FAM/TTATT/Biotin-3′)和擴(kuò)增FHV-1基因目標(biāo)片段的PCR引物序列，(forward：5′-GACGTGGTGAATTATCAGC-3′，reverse：5′-CAACTAGATTTCCACCAGGA-3′，片段大小289 bp)，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 crRNA 制備

使用DNA寡核苷酸退火緩沖液將crRNA-F和crRNA-R融合成雙鏈DNA，反應(yīng)體系配置與條件參照說明書進(jìn)行。然后使用 HiScribe T7 RNA合成試劑盒將雙鏈DNA于37 ℃過夜反應(yīng)體外轉(zhuǎn)錄成crRNA，隨后加入DNase I去除核苷酸模板，并用RNA純化試劑盒進(jìn)行純化，測定濃度后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RPA 反應(yīng)

配置反應(yīng)預(yù)混液體系：Primer Free Rehydration buffer 29.5 μL、Primer A(10 μmol·L)2.4 μL、Primer B(10 μmol·L)2.4 μL和無酶ddHO 12.2 μL。預(yù)混液混勻后分裝至含酶干粉的反應(yīng)管中，分別加入1 μL DNA質(zhì)粒模板，在管蓋上加入2.5 μL 280 mmol·L醋酸鎂，蓋管后，離心混勻，于39 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后，用DNA純化試劑盒純化RPA反應(yīng)產(chǎn)物并進(jìn)行電泳檢測。

1.7 Cas12a的切割反應(yīng)體系

配制酶切割的預(yù)反應(yīng)體系：EnGenLbaCas12a 核酸酶(150 nmol·L)1 μL、crRNA(300 nmol·L)3 μL、10×NEBuffer 2.1 3 μL和無酶 ddHO 18 μL。將混勻的預(yù)反應(yīng)液于25 ℃靜置10 min后加入3 μL RPA產(chǎn)物(30 nmol·L)和2 μL ssDNA報告探針(0.5 μmol·L)，混勻后于37 ℃孵育30 min進(jìn)行切割反應(yīng)。取10 μL切割產(chǎn)物與80 μL 配套緩沖液混勻后滴加至側(cè)流層析試紙條，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果判讀：僅清晰顯示檢測線(T)的為陽性結(jié)果，僅清晰顯示質(zhì)控線(C)的為陰性結(jié)果。

1.8 特異性試驗

用所建的RPA-Cas12a-LFD方法對陽性樣本中的FHV-1和其他8種貓相關(guān)病原(FCV、FAstV、FCoV、FNoV、FPV、、K.P、FM)進(jìn)行檢測，并記錄結(jié)果。

1.9 靈敏性試驗

經(jīng)qPCR方法測定制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)轉(zhuǎn)換公式計算FHV-1質(zhì)粒的初始拷貝數(shù)，然后對目標(biāo)質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，分別用qPCR法以及FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法進(jìn)行檢測，對比兩種方法的靈敏度和符合率。

1.10 臨床樣本檢測

對采集的20份臨床樣本分別用qPCR和FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法進(jìn)行檢測，對比兩種方法的檢出率和符合率。

2 結(jié) 果

2.1 FHV-1 RPA-Cas12a-LFD 反應(yīng)體系驗證

為了確認(rèn)該方法的有效性，比較反應(yīng)體系中組分變化對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，僅完整的反應(yīng)體系可以獲得陽性結(jié)果(圖1)，確證該檢測方法在預(yù)制條件下有效。

圖1 FHV-1 RPA-Cas12a-LFD反應(yīng)體系驗證

2.2 特異性試驗

對FHV-1及8種貓相關(guān)病原DNA或cDNA的RPA反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析和RPA-Cas12a-LFD檢測，除FHV-1外的其他病原均未檢出(圖2)，表明該檢測方法的特異性好。

a.FHV-1和貓相關(guān)病原的RPA產(chǎn)物凝膠電泳分析；b.FHV-1 RPA-Cas12a-LFD檢測結(jié)果

2.3 靈敏度試驗

構(gòu)建的FHV-1質(zhì)粒濃度為74.1 ng·μL，對應(yīng)的拷貝數(shù)為2.35×10copies·μL。將檢測的質(zhì)粒濃度從10梯度稀釋至10，qPCR檢測限為2.35×10copies·μL(圖3a)，F(xiàn)HV-1 RPA-Cas12a-LFD檢測限為2.35×10copies·μL(圖3b)。

a.qPCR擴(kuò)增曲線；b.FHV-1 RPA-Cas12a-LFD檢測結(jié)果。N為陰性對照，1～15質(zhì)粒稀釋濃度為2.35×1010～2.35×10-4 copies·μL-1

2.3 臨床樣本檢測

在20份臨床樣本中，qPCR方法檢出5份陽性(值≤35)和2份疑似樣本(值>35)，檢出率為25%(5/20)。FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法對上述5份陽性樣本的檢測結(jié)果與qPCR相符(符合率100%)，同時對2份疑似樣本的檢測也得到了陽性結(jié)果，實際檢出率為35%(7/20)(圖4)。

a.臨床樣本的qPCR檢測結(jié)果，其中,3號和12號為疑似樣本; b.臨床樣本的RPA-Cas12a-LFD檢測結(jié)果，其中，3號和12號樣本復(fù)核為陽性結(jié)果

3 討 論

FHV-1在多個國家和地區(qū)的貓群中廣泛流行，其引起的反復(fù)性上呼吸道癥狀會嚴(yán)重影響貓的健康和生活質(zhì)量。潛伏感染期的FHV-1病毒會向周圍組織(如三叉神經(jīng)和睫狀神經(jīng)節(jié))分布，而鼻黏膜和結(jié)膜的病原含量顯著降低，可能導(dǎo)致黏膜拭子病原檢測出現(xiàn)陰性結(jié)果。因此，需要尋找靈敏度更高的方法。雖然實時熒光PCR被認(rèn)為是檢測FHV-1的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要在診斷性實驗室和使用梯度溫度循環(huán)儀來完成檢測，故不適合于現(xiàn)場快速檢測。

為了實現(xiàn)病原的快速檢測，Liu等建立了靶向FHV-1 gD基因的RPA-LFD檢測方法，其檢測限為10copies·μL，高于傳統(tǒng)PCR的檢測靈敏度(10copies·μL)。而Wang等則建立了靶向FHV-1基因的exo-RPA熒光檢測方法，檢測限降至10copies·μL，與qPCR檢測結(jié)果相當(dāng)。此外，Tan等靶向FHV-1基因建立的交聯(lián)引物恒溫擴(kuò)增(CPA)檢測法，以SYBR green I作為顯色染料，也同樣獲得10copies·μL的檢測限，但需要分別在梯度熱循環(huán)儀和干濕浴中完成。以上結(jié)果表明，單一基于RPA技術(shù)建立的FHV-1分子檢測方法雖然提升了檢測的靈敏度，但是尚未達(dá)到單拷貝的檢測限。為此，本研究建立了靶向FHV-1基因的RPA-Cas12a-LFD檢測法，并進(jìn)一步提高了病原檢測的靈敏度(2.35×10copies·μL)，低于靶向FHV-1基因的TB green qPCR檢測法(最低檢測限為2.35×10copies·μL)和Hussein等建立的TaqMan qPCR檢測法(最低檢測限為2 copies·μL)，而這一優(yōu)勢可以實現(xiàn)對極微量病原核酸的實時檢測，提高臨床樣本中FHV-1的實際檢出率。

與qPCR變溫梯度擴(kuò)增相比，RPA可在較低溫度(37～43 ℃)和短時間(10～20 min)內(nèi)完成基因擴(kuò)增和檢測信號的放大，且不需要特殊設(shè)備。另外，crRNA引導(dǎo)Cas12a識別特定的基因靶序列并激活其附帶切割活性，也進(jìn)一步提高了FHV-1檢測的特異性。檢測結(jié)果通過側(cè)流層析試紙條實現(xiàn)了可視化，操作友好便捷，非常適合于現(xiàn)場快速檢測，具有臨床推廣價值。

4 結(jié) 論

RPA-Cas12a-LFD檢測法可以特異性地檢測FHV-1基因，最低檢測限為2.35×10copies·μL，可作為FHV-1現(xiàn)場快速檢測的有力工具。