張凱照，胡 會(huì)，許澤鍇，王詩(shī)倩，崔紅杰，黃小紅*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)，中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)，福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

霉菌毒素是絲狀真菌的有毒次生代謝物，常見(jiàn)于農(nóng)作物、谷物和食品污染，其中，玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)的污染問(wèn)題尤為嚴(yán)重[1]。Lee等[2]綜合2006—2016年霉菌毒素調(diào)查報(bào)道發(fā)現(xiàn)，世界范圍內(nèi)谷物原料中ZEA的污染率及平均污染水平為46%和3 049 μg·kg-1，其中，非洲、亞洲和北美污染最嚴(yán)重。我國(guó)學(xué)者在2018年檢測(cè)了從19個(gè)省市收集的422份飼料樣品，發(fā)現(xiàn)飼料中ZEA的檢出率高達(dá)95%，超標(biāo)率為7.9%，遠(yuǎn)高于國(guó)家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB13078—2017)的限量要求[3]。ZEA又稱(chēng)F-2毒素，在動(dòng)物體內(nèi)可以被轉(zhuǎn)化為還原性代謝產(chǎn)物，如α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇等[4]。ZEA及其代謝物具有類(lèi)雌激素作用，并能擾亂動(dòng)物的內(nèi)分泌功能[5]。攝入霉菌毒素可以引起動(dòng)物的生產(chǎn)性能下降，引發(fā)急性或慢性的中毒反應(yīng)，進(jìn)而威脅動(dòng)物和人類(lèi)健康，并給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失[6]。

ZEA除了具有雌激素活性外，還通過(guò)多種損傷機(jī)制發(fā)揮毒性作用，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體損傷、細(xì)胞周期阻滯、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和壞死等。ZEA能降低草魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能，損害草魚(yú)腸道結(jié)構(gòu)完整性，使草魚(yú)腸道細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，產(chǎn)生腸道毒性[7]。采用腹腔注射的方式給小鼠注射 50 mg·kg-1劑量的 ZEA，可觀察到肝壞死、肝細(xì)胞變性和腎上皮細(xì)胞腫脹變性；組織細(xì)胞的氧化損傷是目前普遍接受的ZEA引起肝腎損傷機(jī)制之一[8]。體內(nèi)外研究表明，ZEA對(duì)免疫應(yīng)答也有顯著影響，有免疫刺激或免疫抑制作用[9]。李欣虹等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA能誘導(dǎo)雞脾淋巴細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，抑制細(xì)胞增殖。此外，ZEA對(duì)多種類(lèi)型細(xì)胞具有時(shí)間和劑量依賴性的負(fù)效應(yīng)，如ZEA及其衍生物會(huì)對(duì)大鼠支持細(xì)胞和小鼠卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[11-12]；40 μmol·L-1ZEA能抑制豬小腸上皮細(xì)胞增殖，并在24 h內(nèi)降低所有濃度(ZEA濃度<100 μmol·L-1)的細(xì)胞活力[13]；Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的ZEA能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)大鼠原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。

雖然目前ZEA對(duì)禽類(lèi)的毒性作用已有報(bào)道，但關(guān)于ZEA對(duì)禽類(lèi)的毒性作用機(jī)制研究仍不完善。利用內(nèi)分泌細(xì)胞和生殖細(xì)胞來(lái)評(píng)估ZEA的毒理學(xué)效應(yīng)，但成纖維細(xì)胞的潛在影響一直被忽視，成纖維細(xì)胞在組織發(fā)育、維持和修復(fù)方面具有重要作用[15]。雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)是一種穩(wěn)定的、無(wú)腫瘤基因、自發(fā)無(wú)限增殖的細(xì)胞系，被廣泛用于動(dòng)物病毒研究、疫苗研制、癌癥研究等諸多領(lǐng)域。因此，本試驗(yàn)選用DF-1作為供試細(xì)胞，探究ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞的毒性作用，旨在進(jìn)一步探討ZEA的毒性作用機(jī)制與禽類(lèi)疾病的確切關(guān)系，為正確指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖和防控霉菌毒素中毒提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、PBS和青霉素-鏈霉素溶液等均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；二甲基亞砜(DMSO)和玉米赤霉烯酮(ZEA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲基噻唑藍(lán)MTT購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；LDH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Caspase-3、ROS、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。雞胚成纖維細(xì)胞DF-1(ATCC; CRL-12203)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞活力的影響

DF-1細(xì)胞按4.5×103個(gè)·孔-1接種至96孔板中，置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度ZEA(ZEA終濃度分別為12.5、25.0和50.0 μg·mL-1)的培養(yǎng)基。以不加ZEA的細(xì)胞作為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值表示。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率=(處理組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100。

1.3 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞形態(tài)的影響

DF-1細(xì)胞按7×104個(gè)·孔-1接種至6孔板中，置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度ZEA(ZEA終濃度分別為12.5、25.0和50.0 μg·mL-1)的培養(yǎng)基。以不加ZEA的細(xì)胞作為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞上清液中LDH的影響

DF-1細(xì)胞按7×104個(gè)·孔-1接種至6孔板中，置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入ZEA終濃度為25.0 μg·mL-1的培養(yǎng)基。以不加ZEA的細(xì)胞作為對(duì)照組，各設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液，按照LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作檢測(cè)上清液中LDH的活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞上清液中Caspase-3含量的影響

細(xì)胞接種和藥物處理方法同“1.4”，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中Caspase-3的含量。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞接板和藥物處理方法同“1.4”，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，準(zhǔn)備好細(xì)胞樣品，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞中活性氧水平的影響

細(xì)胞接種和藥物處理方法同“1.4”，加入含DCFH-DA熒光染料的培養(yǎng)液，37 ℃避光孵育20 min，PBS洗滌3次后用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.8 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響

細(xì)胞接種和藥物處理方法同“1.4”，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入含JC-1熒光染料的培養(yǎng)液，37 ℃避光孵育20 min，用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次，用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.9 ZEA處理對(duì)DF-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

細(xì)胞接種和藥物處理方法同“1.4”，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，3 000 r·min-14 ℃離心10 min收集細(xì)胞，使用TRIzol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。檢測(cè)細(xì)胞凋亡(Bcl-2、Caspase-3、Bax)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因(ATF4、ATF6、GRP78、CHOP、IRE1、PERK)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。具體引物序列見(jiàn)表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算分析結(jié)果。

表1 熒光定量 PCR 引物序列信息

1.10 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞形態(tài)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，ZEA濃度越高，細(xì)胞形態(tài)越差、皺縮、欠規(guī)則、呈圓形或卵圓形、折光性差、貼壁細(xì)胞減少，死亡細(xì)胞增多。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，隨著ZEA濃度增加、作用時(shí)間增長(zhǎng)，ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞活力的抑制作用增強(qiáng)，呈時(shí)間和劑量依賴性關(guān)系，25.0 μg·mL-1ZEA處理DF-1細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力約為50%，因此試驗(yàn)選取25.0 μg·mL-1ZEA處理DF-1細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

A.對(duì)照組；B.12.5 μg·mL-1 ZEA處理組；C.25.0 μg·mL-1 ZEA處理組；D.50.0 μg·mL-1 ZEA處理組。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖

與對(duì)照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01。下同

2.2 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，25.0 μg·mL-1ZEA處理組LDH活性極顯著升高(P<0.01)，約為正常細(xì)胞的6倍。表明25.0 μg·mL-1ZEA作用于DF-1細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

圖3 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞上清液中LDH活性的影響

2.3 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞上清液中Caspase-3 含量的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，25.0 μg·mL-1ZEA處理DF-1細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中Caspase-3含量極顯著升高(P<0.01)，約為正常細(xì)胞的2倍。表明25.0 μg·mL-1ZEA作用于DF-1細(xì)胞后會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡。

圖4 ZEA 對(duì)DF-1細(xì)胞上清液中Caspase-3含量的影響

2.4 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞凋亡的影響

由圖5可知，Q1表示壞死細(xì)胞，Q2表示晚期凋亡細(xì)胞，Q3表示早期凋亡細(xì)胞、Q4表示活細(xì)胞。與對(duì)照組相比，25.0 μg·mL-1ZEA處理組的早凋(Q3)和晚凋(Q2)細(xì)胞數(shù)顯著增加，表明25.0 μg·mL-1ZEA作用于DF-1細(xì)胞后會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡。

圖5 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞凋亡的影響(掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖)

2.5 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞活性氧水平的影響

由圖6A可知，與對(duì)照組相比，25.0 μg·mL-1ZEA處理組綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，細(xì)胞核呈濃縮、致密濃染。由圖6B可知，與對(duì)照組相比較，25.0 μg·mL-1ZEA 處理后的DF-1細(xì)胞ROS水平極顯著增加(P<0.01)，約為正常細(xì)胞的20倍，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。

A.細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化的熒光染色結(jié)果(標(biāo)尺=100 μm,掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖)；B.ROS熒光強(qiáng)度分析

2.6 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響

由圖7可知，與對(duì)照組相比，25.0 μg·mL-1ZEA處理組紅色熒光明顯減弱，綠色熒光明顯增強(qiáng)，由圖8可知，與對(duì)照組相比較，25.0 μg·mL-1ZEA處理后的DF-1細(xì)胞線粒體膜電位極顯著降低(P<0.01)，約為正常細(xì)胞的1/7，說(shuō)明ZEA能造成DF-1細(xì)胞線粒體損傷。

圖7 線粒體膜電位熒光染色結(jié)果(標(biāo)尺=100 μm，掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖)

圖8 線粒體膜電位紅綠熒光強(qiáng)度比值分析

2.7 DF-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bax、Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平，由圖9可知，與對(duì)照組相比，25.0 μg·mL-1ZEA組的促凋亡基因Caspase-3mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)(P<0.01)、BaxmRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)(P<0.01)；抑凋亡基因Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)(P<0.01)。從mRNA轉(zhuǎn)錄水平表明ZEA能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖9 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.8 DF-1細(xì)胞ERs相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)ERs相關(guān)基因CHOP、GRP78、PERK、ATF6、ATF4、IRE1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，由圖10可知，與對(duì)照組相比，25.0 μg·mL-1ZEA組CHOP、GRP78、PERK、ATF6、ATF4、IRE1mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)(P<0.01)。從mRNA轉(zhuǎn)錄水平表明ZEA能誘導(dǎo)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

圖10 ZEA對(duì)DF-1細(xì)胞ERs相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

3 討 論

人或畜禽通過(guò)飲食將ZEA攝入體內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生免疫毒性、生殖毒性、腸道毒性、肝腎毒性、細(xì)胞毒性、甚至致癌性，嚴(yán)重危害人類(lèi)和畜禽健康，降低動(dòng)物生產(chǎn)性能，帶來(lái)不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[16]。成纖維細(xì)胞代謝旺盛、增殖能力強(qiáng)，具有合成和分泌蛋白質(zhì)的功能[17]。而DF-1是一種雞的典型成纖維細(xì)胞模型，常用來(lái)研究雞細(xì)胞的功能和變化，因此，本試驗(yàn)以DF-1為模型研究ZEA的毒性作用機(jī)制。

乳酸脫氫酶(LDH)是細(xì)胞內(nèi)一種穩(wěn)定的酶，LDH的釋放是檢測(cè)細(xì)胞毒性和細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)液中[18]。本研究通過(guò)細(xì)胞活力及LDH的檢測(cè)表明ZEA對(duì) DF-1細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，并抑制DF-1細(xì)胞的活力。與此一致，陳新亮[19]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA使MODE-K細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)氧化，細(xì)胞破損，使細(xì)胞內(nèi)的LDH活性顯著升高。

活性氧(ROS)是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要信號(hào)分子，ROS的過(guò)度積累可破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，直接或間接(或同時(shí))影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和蛋白質(zhì)折疊[20]。大量體外研究表明，ZEA通過(guò)ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷和細(xì)胞凋亡[21]。線粒體是細(xì)胞的發(fā)電站，消耗氧氣以產(chǎn)生足夠的能量來(lái)維持正常的細(xì)胞過(guò)程，其電位變化可以反映出細(xì)胞的狀態(tài)。此外，線粒體膜電位是檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期的重要標(biāo)志，也是檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期階段的方式之一[22]。張心怡等[23]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA處理小鼠T淋巴細(xì)胞可以提高細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，同時(shí)降低T淋巴細(xì)胞線粒體膜電位。本研究使用25.0 μg·mL-1ZEA處理 DF-1細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，ZEA組ROS顯著升高，線粒體膜電位降低，引起線粒體損傷。與張心怡等[23]研究結(jié)果一致，這一結(jié)果也表明ZEA對(duì)多種類(lèi)型細(xì)胞具有毒性作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)控中發(fā)揮重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能的損傷，如未折疊蛋白的積累、腔內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的紊亂和氧化應(yīng)激會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERs)，進(jìn)而觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)[24]。UPR是一種適應(yīng)性反應(yīng)，通過(guò)激活3個(gè)近端傳感器IRE1、ATF6和PERK來(lái)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。但是，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激嚴(yán)重或延長(zhǎng)，UPR通過(guò)激活下游效應(yīng)因子，包括CHOP、JNK、Caspases和Bcl-2家族成員，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]。王宗捷等[26]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA可以通過(guò)ERs通路調(diào)控山羊 ESCs細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。在DF-1細(xì)胞中，作者發(fā)現(xiàn)ZEA處理細(xì)胞后，ERs相關(guān)基因CHOP、GRP78、PERK、ATF6、ATF4、IRE1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，表明該霉菌毒素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激足以激活UPR的促凋亡通路。GRP78 是ERs的標(biāo)志物之一，GRP78上調(diào)表明ERs增加[27]，而ATF6是GRP78的最佳表達(dá)伴侶[28]。有報(bào)道稱(chēng)其他霉菌毒素也會(huì)引起不同細(xì)胞的ERs，比如木霉菌素、HT-2毒素等[29-30]。說(shuō)明誘導(dǎo)ERs可能是霉菌毒素毒性的一個(gè)共同特征。

由于ROS的增加，線粒體膜電位的降低和ERs的發(fā)生，試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè) ZEA 處理后DF-1細(xì)胞是否發(fā)生細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是ZEA造成細(xì)胞毒性的重要途徑，是細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，主要分為兩類(lèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，1)線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與的內(nèi)源性途徑，2)死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑[31]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析表明，ZEA處理后DF-1細(xì)胞凋亡率顯著升高。Bcl-2家族蛋白分為促凋亡和抑凋亡兩種，在細(xì)胞線粒體凋亡途徑中至關(guān)重要[32]。接收到凋亡信號(hào)后，Bcl-2在線粒體外膜通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax進(jìn)入線粒體使線粒體膜通透性增加、去極化，釋放細(xì)胞色素C，激活線粒體通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[33]。抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的比例能決定細(xì)胞是否凋亡[34]。Caspase-3蛋白家族在凋亡的啟動(dòng)中十分重要，其中，Caspase-3是主要的啟動(dòng)子，它活化會(huì)使DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚、最終生成凋亡小體[35]。本研究用ZEA處理DF-1細(xì)胞后上清中Caspase-3含量顯著增加，抑凋亡基因Bcl-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，Bax和Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，這表明ZEA會(huì)導(dǎo)致DF-1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

ZEA主要通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活細(xì)胞凋亡途徑對(duì)DF-1細(xì)胞發(fā)揮毒性作用。本研究為深入探討ZEA的毒性作用機(jī)制、與人畜疾病的確切關(guān)系及相關(guān)疾病治療奠定基礎(chǔ)。