何 慶，李周勉，王 歡，李丹彤，譚慶輝，鄒亞文，蘇建明，鄧治邦，楊 毅，王乃東*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 獸用蛋白質(zhì)工程疫苗湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 獸用疫苗逆向創(chuàng)制湖南省工程研究中心，長(zhǎng)沙 410128；2.長(zhǎng)沙市望城區(qū)高塘嶺街道農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，長(zhǎng)沙 410128；3.婁底市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，婁底 417000)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCVs)是目前報(bào)道最小的單股負(fù)鏈DNA病毒，病毒粒子大小為17 nm左右，呈正20面體結(jié)構(gòu)。迄今為止，PCVs分為4種(即PCV1、PCV2、PCV3和PCV4)，其中PCV1無(wú)致病性；PCV2能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PWMS)等一系列豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，給世界生豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失；PCV3是于2016年在美國(guó)從患有豬皮炎腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)和繁殖障礙母豬及其流產(chǎn)胎兒體內(nèi)鑒定出的新型豬圓環(huán)病毒，其致病性目前尚不明確；而PCV4是于2020年在中國(guó)湖南病豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新型豬圓環(huán)病毒。

PCV3已在日本、中國(guó)、瑞典、俄羅斯、巴西、丹麥、意大利和西班牙等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，PCV3通常與PCV2、PEDV、TTSuV和PPV等其他病毒發(fā)生混合感染，并且PCV3還可以感染犬和牛等其他動(dòng)物。PCV3基因組全長(zhǎng)為2 000 bp，與PCV1和PCV2基因組序列的相似性僅為31%～48%，與PCV4的相似性為43.2%。PCV3包括3個(gè)主要開放閱讀框(open reading frames，ORFs)，ORF1具有非ATG啟動(dòng)子(GTC)，編碼由296～297 aa組成的復(fù)制酶(replication-associated protein，Rep)；ORF2編碼214 aa組成的衣殼蛋白(capsid protein，Cap)，與蝙蝠圓環(huán)病毒相似性為35%，與PCV2 Cap的核苷酸和氨基酸相似性僅36%和26%，有研究表明，PCV2和PCV3不具有交叉免疫保護(hù)的特性?；赑CV3唯一結(jié)構(gòu)蛋白Cap的兩個(gè)突變位點(diǎn)(A24V和R27K)，可將PCV3分為PCV3a、PCV3b和PCV3c。根據(jù)已有報(bào)道，PCV3的突變位點(diǎn)主要位于Cap蛋白，且集中在R10K、A24V、K77R、N56D、S77T、F104Y和I150L。多項(xiàng)研究認(rèn)為PCV3感染主要與繁殖障礙和皮炎腎病綜合征等臨床癥狀有關(guān)。

目前，在我國(guó)已有27個(gè)省級(jí)行政區(qū)域報(bào)道了PCV3陽(yáng)性病例，PCV3廣泛流行對(duì)我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)造成了威脅。為分析豬流產(chǎn)胎兒中PCV3的感染及其遺傳進(jìn)化情況，本研究采用PCR檢測(cè)方法對(duì)2015—2017年采集的豬流產(chǎn)胎兒病料進(jìn)行PCV3的檢測(cè)，結(jié)合序列的生物信息學(xué)分析，解析其遺傳進(jìn)化規(guī)律，為后續(xù)深入研究PCV3遺傳變異及其相關(guān)致病性提供了重要參考信息。

1 材料與方法

1.1 臨床病料及試劑

2015—2017年，從湖南省長(zhǎng)沙市、湘潭市和婁底市等12個(gè)行政區(qū)域的30個(gè)豬場(chǎng)共采集了680份表現(xiàn)為弱胎、死胎和木乃伊胎等臨床癥狀的流產(chǎn)胎兒病料(肺、淋巴結(jié)、肝、脾、腎、血清等)，提取病料中病毒基因組DNA后-80 ℃保存于實(shí)驗(yàn)室。2×Easy聚合酶和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒、OMEGA瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和小提質(zhì)粒試劑盒，均購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中登錄的全長(zhǎng)PCV3序列為模板(GenBank：KY363870.1)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物檢測(cè)PCV3及擴(kuò)增ORF2基因序列；設(shè)計(jì)3對(duì)引物分段擴(kuò)增PCV3全基因組(見表1)。參考實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)，合成PCV2檢測(cè)引物，引物均由擎科新業(yè)生物技術(shù)(長(zhǎng)沙)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.3 PCV3 ORF2基因的PCR擴(kuò)增

向適量的病料中加入PBS緩沖液，在無(wú)菌條件下研磨，并反復(fù)凍融3次, 6 000×離心10 min, 取上清用于病毒核酸的提取，病毒基因組提取嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用PCR方法檢測(cè)PCV3，PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中，25 μL 2×Easy聚合酶，模板DNA 5 μL，上下游引物各2 μL，ddHO 16 μL。反應(yīng)條件：95 ℃2 min；95 ℃ 20 s，56 ℃20 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 PCV3全基因組擴(kuò)增

采用3對(duì)引物(PCV3-P1、PCV3-P2和PCV3-P3，表1)分段擴(kuò)增PCV3全基因組，PCR反應(yīng)體系同“1.3”。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 PCV2 PCR檢測(cè)

采用常規(guī)PCR方法對(duì)PCV3陽(yáng)性樣本，進(jìn)行PCV2檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中，25 μL 2×Easy聚合酶，模板DNA 5 μL，上下游引物各2 μL，ddHO 16 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 目的片段膠回收、克隆鑒定和測(cè)序

對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本，用OMEGA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T克隆載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落繼續(xù)擴(kuò)增過(guò)夜，提取質(zhì)粒后送長(zhǎng)沙擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 PCV3全基因組和ORF2基因變異與演化分析

使用DNAStar軟件對(duì)PCV3全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，將其與國(guó)內(nèi)外參考毒株序列進(jìn)行同源性分析、比對(duì)。利用MEGA 5.0軟件，使用Neighbor-joining法對(duì)獲得的PCV3全基因組序列和Cap蛋白氨基酸序列分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過(guò)ClustalW軟件對(duì)PCV3 Cap蛋白氨基酸進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 豬流產(chǎn)胎兒樣品中PCV3檢出情況

為了調(diào)查豬流產(chǎn)胎兒中PCV3感染率，選擇2015—2017年湖南省12個(gè)行政區(qū)域的豬場(chǎng)采集保存的680份流產(chǎn)胎兒病料，提取病毒基因組DNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結(jié)果顯示(部分病料的檢測(cè)見圖1)：在680份病料中共檢測(cè)出166份病料呈PCV3陽(yáng)性，PCV3陽(yáng)性率為24.4%(166/680)，其中，2015年為18.2%(26/143)，2016年為22.7%(54/238)，2017年為28.8%(86/299)(圖2A)。在湖南省各個(gè)地區(qū)的樣本中均檢測(cè)出PCV3陽(yáng)性(圖2B)：長(zhǎng)沙(39/166)、益陽(yáng)(7/166)、婁底(24/166)、湘潭(19/166)、株洲(12/166)、永州(6/166)、常德(2/166)、邵陽(yáng)(8/166)、郴州(10/166)、岳陽(yáng)(27/166)、湘西(4/166)和懷化(8/166)，說(shuō)明PCV3在湖南省地區(qū)豬流產(chǎn)胎兒中廣泛存在。對(duì)PCV3陽(yáng)性樣本DNA進(jìn)行PCV2混合感染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，166份病料中共有49份呈PCV2陽(yáng)性，PCV3和PCV2 混合感染率為29.5%(49/166)。

1～9.臨床樣品；NC.陰性對(duì)照；M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

A.2015—2017年采集病料樣品的PCV3陽(yáng)性率；B.PCV3陽(yáng)性樣品的地區(qū)分布

2.2 基因組序列相似性分析

重組陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序、拼接，獲得1株P(guān)CV3全基因組序列，序列全長(zhǎng)2 000 nt，將該序列命名為PCV3/CN/Hunan-57(GenBank登錄號(hào)為MZ934695)。利用MEGA 5.0軟件將PCV3/CN/Hunan-57序列與NCBI上報(bào)道的國(guó)內(nèi)外PCV3毒株序列進(jìn)行比對(duì)分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。發(fā)現(xiàn)PCV3/CN/Hunan-57與參考毒株序列相似性為97.8%～99.2%。其中，與PCV3-CN/FuJian-1215-2016(KY924474)和CN/Hubei-610/2016(KY354038)親緣關(guān)系最近，與PCV3/CN/Fujian-12/2016毒株(KY075987)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

黑色圓點(diǎn)表示本研究此次獲得的PCV3基因組序列

2.3 Cap的遺傳演化分析

從PCV3陽(yáng)性樣品中擴(kuò)增獲得了5株P(guān)CV3 Cap序列(CHN/HN-1/2016、CHN/HN-2/2016、CHN/HN-3/2016、CHN/HN-4/2017和CHN/HN-5/2017)，與GenBank已登錄的PCV3 Cap序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，PCV3可分為PCV3a、PCV3b和PCV3c 3個(gè)亞群(圖4)，本試驗(yàn)獲得的PCV3序列分別位于其中2個(gè)亞群上，1株屬于PCV3a(24 A和27 R)，4株屬于PCV3c(24 V和27 K)。CHN/HN-1/2016和CHN/HN-3/2016與這3株參考毒株[PCV3/CN/Guangdong-SG/2016(MF589117)、PCV3/CN/Hunan-CZ/2017(MF589126)和PCV3/CN/Guangxi-L2/2017(MF589119)]親緣關(guān)系較近。此外CHN/HN-4/2017和CHN/HN-5/2017處于同一進(jìn)化分支，同源關(guān)系較近。CHN/HN-2/2016與其余毒株處于不同進(jìn)化分支，提示有不同類型的PCV3毒株在湖南省地區(qū)豬流產(chǎn)胎兒中流行。

黑色圓點(diǎn)表示本研究此次獲得的PCV3 Cap基因序列

2.4 Cap同源性分析和多重序列比對(duì)

同源性分析結(jié)果顯示，獲得的5株P(guān)CV3 ORF2基因序列之間的核苷酸和氨基酸相似性分別為97.5%～98.3%和96.7%～99.7%，與國(guó)內(nèi)外參考毒株ORF2基因序列相比，其核苷酸和氨基酸相似性分別為96.3%～99.2%和96.8%～100.0%。對(duì)獲得的5株和GenBank報(bào)道的PCV3 Cap蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，以評(píng)估PCV3 Cap蛋白的氨基酸突變。結(jié)果顯示，PCV3a突變頻率高于PCV3b和PCV3c，從流產(chǎn)胎兒樣品獲得的Cap序列中鑒定出T100A、G113S和A184S突變位點(diǎn)(圖5)，基于截至2021年8月10日的GenBank中PCV3序列同源性分析，本研究鑒定的氨基酸突變位點(diǎn)在已經(jīng)報(bào)道的PCV3序列中未出現(xiàn)。

黑色方框表示鑒定出的新氨基酸突變位點(diǎn)

3 討 論

PCV3自2016年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，陸續(xù)在不同臨床癥狀(如PDNS、母豬繁殖障礙、多系統(tǒng)炎癥和神經(jīng)癥狀等)或健康豬中檢測(cè)出PCV3感染，其中繁殖障礙和多系統(tǒng)炎癥是報(bào)道最多的臨床癥狀。Deim等從豬流產(chǎn)胎兒和弱仔的多種器官中檢測(cè)到PCV3感染；Santo等對(duì)276例木乃伊胎進(jìn)行病原體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)270例檢測(cè)為PCV3陽(yáng)性，其中,PCV3單獨(dú)感染僅有12例；Saporiti等通過(guò)原位雜交(hybridization，ISH)方法在豬流產(chǎn)胎兒的組織學(xué)病變中發(fā)現(xiàn)PCV3基因組；Zou等研究發(fā)現(xiàn)有繁殖障礙癥狀的母豬中PCV3陽(yáng)性率高于健康母豬，Kedkovid等發(fā)現(xiàn)母豬的初乳樣本中PCV3陽(yáng)性率為44.74%(17/38)，血清樣本中陽(yáng)性率為47.37%(18/38)；初產(chǎn)母豬的初乳樣本中PCV3陽(yáng)性率高達(dá)71%，高于經(jīng)產(chǎn)母豬陽(yáng)性率(33%～43%)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)初產(chǎn)母豬的PCV3感染胎兒數(shù)量顯著高于經(jīng)產(chǎn)母豬，且PCV3病毒載量較高，這些進(jìn)展進(jìn)一步證實(shí)了PCV3在導(dǎo)致母豬繁殖障礙中具有潛在的作用。

近期報(bào)道西班牙農(nóng)場(chǎng)中豬流產(chǎn)胎兒或死產(chǎn)仔豬組織樣品的qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCV3陽(yáng)性率為33.9%，本研究對(duì)湖南省680份豬流產(chǎn)胎兒病料樣品PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCV3陽(yáng)性率也較高(24.4%)，并且PCV3陽(yáng)性率在2015—2017年，呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，說(shuō)明PCV3在流產(chǎn)胎兒中一直有較高水平的流行。盡管多數(shù)報(bào)道中認(rèn)為PCV3是一種可導(dǎo)致母豬繁殖障礙的病原體，但仍需進(jìn)一步分離毒株，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證PCV3對(duì)母豬或胎兒、仔豬的具體致病性。

PCV2誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖或免疫抑制可增強(qiáng)對(duì)其他病毒復(fù)制和感染的易感性，而PCV3與其他病原混合感染后的影響尚不完全清楚。Ha等統(tǒng)計(jì)分析顯示，PCV3可能提高PCV2和PRRSV感染率，并與豬臨床疾病有潛在關(guān)聯(lián)。在作者前期的另一項(xiàng)PCV3和PPV7混合感染檢測(cè)研究中發(fā)現(xiàn)，母豬PPV7 陽(yáng)性血清樣本中PCV3的拷貝數(shù)顯著高于PPV7陰性血清樣本，因此推測(cè)PPV7可能促進(jìn)PCV3復(fù)制。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCV3和PCV2混合感染可達(dá)29.5%(49/166)，這與前期國(guó)內(nèi)外的報(bào)道基本一致。鑒于PCV3臨床混合感染和母豬繁殖障礙影響的存在，需加強(qiáng)PCV3與豬常見繁殖障礙病原體的混合感染檢測(cè)(如新一代測(cè)序NGS)，并探索PCV3混合感染與繁殖障礙等致病性的關(guān)系。

PCV3結(jié)構(gòu)蛋白Cap突變可能會(huì)影響PCV3的毒力和致病性。Ha等對(duì)PCV3進(jìn)化過(guò)程中Cap蛋白主要氨基酸的突變情況進(jìn)行了分析，其中突變頻率最高的氨基酸位點(diǎn)分別為A24V、K27R、S77T、F104Y和I150L。前期報(bào)道臨床表現(xiàn)有繁殖障礙的母豬和流產(chǎn)胎兒樣品中的 PCV3 Cap序列均存在S77T和I150L突變位點(diǎn)，且這些突變位點(diǎn)常出現(xiàn)在PCV3a毒株。近期有研究表明，從越南豬流產(chǎn)胎兒中鑒定出3個(gè)PCV3 Cap蛋白的新突變位點(diǎn)(K139R、I150F和P169T)。本研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自豬流產(chǎn)胎兒的PCV3 Cap序列中出現(xiàn)T100A、G113S和A184S新的突變位點(diǎn)，且進(jìn)化分析顯示，陽(yáng)性毒株均屬于PCV3c，這表明雖然PCV3基因組穩(wěn)定，但仍在不斷適應(yīng)進(jìn)化，而Cap突變位點(diǎn)的改變是否影響PCV3感染和致病性需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)湖南省地區(qū)于2015—2017年采集的豬流產(chǎn)胎兒病料樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明豬流產(chǎn)胎兒中PCV3感染率較高，且存在不同類型的PCV3毒株感染。