何 雪，王 凝，華瑞其，杜小迪，楊光友

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都611130)

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)()屬于帶科()棘球?qū)?)，其中絳期幼蟲(chóng)寄生于人和多種動(dòng)物的組織器官內(nèi)時(shí)會(huì)引起囊型包蟲(chóng)病(cystic echinococcosis, CE)。該病呈世界性分布，南美、東歐、中東、南非、亞洲以及地中海地區(qū)為主要流行區(qū)域，其中，中國(guó)也是全球范圍內(nèi)包蟲(chóng)病流行最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生安全問(wèn)題。囊型包蟲(chóng)病的主要特征是在肝、肺等組織器官內(nèi)形成多個(gè)大小不等的包囊，包囊由囊壁和囊液組成。囊壁包括內(nèi)部的生發(fā)層(germinal layer)和外部的角質(zhì)層(laminated layer)。此外，囊壁外還有一層致密的纖維組織層(adventitial layer)。包囊分為育囊和不育囊，育囊內(nèi)含大量的原頭蚴，不育囊內(nèi)無(wú)原頭蚴存在，因此不育囊不能感染終末宿主，但仍能對(duì)中間宿主組織器官造成嚴(yán)重?fù)p傷。目前，不育囊的形成機(jī)制尚不明確，但有研究顯示細(xì)胞凋亡可能與不育囊形成之間有著密切聯(lián)系，因此，調(diào)控細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因可能在此過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。

BAG3屬于Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因(Bcl-2 associated athanogene，BAG)家族，該家族的成員均含有一個(gè)位于C端的BAG結(jié)構(gòu)域，BAG蛋白通過(guò)該結(jié)構(gòu)域可與熱休克蛋白70(heat shock protein, HSP70)的ATP酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，作為HSP70的共-分子伴侶從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。內(nèi)吞蛋白B1(endophilin B1，EB1)，又稱作Bax蛋白互作因子 1(Bax-interacting factor 1, Bif-1)，為內(nèi)吞蛋白家族(endophilin)的一員，廣泛參與細(xì)胞凋亡、自噬、線粒體功能調(diào)控等細(xì)胞生理學(xué)過(guò)程，EB1蛋白作為Bax蛋白的激活因子，目前其促凋亡作用已被研究證實(shí)。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組中存在BAG3和EB1基因，但目前尚無(wú)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)BAG3和EB1基因功能的研究報(bào)道，二者在蟲(chóng)體細(xì)胞凋亡過(guò)程中是否具有調(diào)控作用也不清楚。為此，本研究通過(guò)克隆、表達(dá)了Eg-BAG3和Eg-EB1基因，對(duì)其蛋白分子特性及其在原頭蚴細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了探究，以期為細(xì)粒棘球蚴不育囊的形成機(jī)制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；PrimeScriptDouble Strand cDNA Synthesis Kit、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶(H Ⅰ、R Ⅰ、Ⅰ)及T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；總蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技公司；HRP Conjugated Goat Anti-rabbit IgG(H+L)及FITC Conjugated Goat Anti-rabbit IgG(H+L)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RNA轉(zhuǎn)染試劑EntransterTM-R4000、RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清分別購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司和美國(guó)Hyclone公司；pET-28a(+)、pET-32a(+)載體和弗氏(不)完全佐劑分別購(gòu)自美國(guó)Invitrogen和Sigma公司；Ni親和層析柱和HiTrap Protein A預(yù)裝柱購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。PCR引物合成及質(zhì)粒測(cè)序交由上海生工生物工程有限公司完成，siRNA由上海吉瑪公司合成。免疫印跡對(duì)照蛋白：西氏貝蛔蟲(chóng)()重組硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(rBs-Tpx)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲(chóng)病研究中心提供。

1.2 動(dòng)物倫理學(xué)聲明

本研究得到四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及試驗(yàn)操作程序嚴(yán)格按照“四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理指南”(SYXK2014-187，中國(guó)成都)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.3 蟲(chóng)體、血清及動(dòng)物

細(xì)粒棘球蚴包囊采自四川某屠宰場(chǎng)自然感染囊型包蟲(chóng)病綿羊的肝或肺。在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌條件下利用無(wú)菌注射器抽出包囊液并于普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，根據(jù)是否含有原頭蚴將包囊鑒定為育囊和不育囊，隨后將從育囊中獲得的囊液經(jīng)4 000 r·min離心10 min，無(wú)菌PBS清洗3次后分離得到原頭蚴。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)45日齡成蟲(chóng)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲(chóng)病研究中心提供。綿羊陽(yáng)性血清和陰性血清分別來(lái)自于自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊和非包蟲(chóng)病流行區(qū)域的健康綿羊，二者通過(guò)尸體剖解確定。4只2.0～2.5 kg健康雄性新西蘭兔購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Eg-BAG3(登錄號(hào)：XM_024490124.1)和Eg-EB1(登錄號(hào): CDS21096.1)基因的全長(zhǎng)編碼序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用Expasy(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白基本理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)目、分子量和等電點(diǎn)；蛋白信號(hào)肽、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域及二級(jí)結(jié)構(gòu)分別利用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)、TMHMM-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)、WOLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)、InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)和SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行預(yù)測(cè)。此外，利用DNAMAN軟件和MEGA軟件(version 5.05)分別對(duì)Eg-BAG3、Eg-EB1及其同源基因進(jìn)行多序列比對(duì)并采用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 Eg-BAG3和Eg-EB1的克隆、表達(dá)與純化

利用動(dòng)物組織RNA提取試劑盒提取原頭蚴總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參考數(shù)據(jù)庫(kù)中Eg-BAG3和Eg-EB1基因的全長(zhǎng)編碼序列設(shè)計(jì)特異性引物，其中Eg-BAG3上游和下游引物分別是5′-CGCATGTCGGTGCCTCACGTT-3′(下劃線為H Ⅰ酶切位點(diǎn))和5′-CCGCTAAGCATCGCTTTCCTTTG-3′(下劃線為R Ⅰ酶切位點(diǎn))；Eg-EB1上游和下游引物分別是5′-CGCATGAATTACTTGTTCATCGTTTTC-3′(下劃線為H Ⅰ酶切位點(diǎn))和5′-CCTACTCGCCCAGCATCATAC-3′(下劃線為Ⅰ酶切位點(diǎn))，隨后利用提取的原頭蚴cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性45 s，58 ℃退火1 min,72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆導(dǎo)入pMD19-T載體并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性后提取質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測(cè)序。將構(gòu)建成功的pMD19-T-Eg-BAG3及 pMD19-T-Eg-EB1質(zhì)粒雙酶切回收后分別亞克隆入pET-28a(+)和pET-32a(+)載體中，隨后將構(gòu)建成功的pET-28a(+)-Eg-BAG3和pET-32a(+)-Eg-EB1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌中，于37 ℃條件下加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集菌體并超聲破碎菌體，離心后收集上清液及沉淀，二者均進(jìn)行SDS-PAGE以驗(yàn)證重組蛋白的主要表達(dá)形式，隨后利用Ni親和層析柱純化上清或者沉淀中的表達(dá)產(chǎn)物，12% SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白表達(dá)及純化效果。

1.6 多克隆抗體制備

兔抗rEg-BAG3 IgG和兔抗rEg-EB1 IgG按照以下步驟制備：首次免疫時(shí)，將200 μg純化后的重組蛋白利用等體積的完全弗氏佐劑充分乳化，然后以皮下注射方式對(duì)4只新西蘭兔進(jìn)行免疫，每種蛋白免疫2只。隨后利用不完全弗氏佐劑和重組蛋白連續(xù)加強(qiáng)免疫3次，每次間隔一周，最后一次免疫一周后采血分離血清，并利用HiTrap Protein A預(yù)裝柱純化獲得IgG。此外，免疫前對(duì)4只新西蘭兔進(jìn)行采血獲得陰性血清。

1.7 免疫印跡

利用貝博總蛋白提取試劑盒提取原頭蚴總蛋白，制備12%SDS-PAGE電泳凝膠，對(duì)純化的rEg-BAG3、rEg-EB1、西氏貝蛔蟲(chóng)重組硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(rBs-Tpx)及原頭蚴總蛋白進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)上，TBST洗膜3次(每次5 min)后加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，封閉完成后，加入綿羊陰性血清、綿羊陽(yáng)性血清(1∶100稀釋)、兔陰性血清、兔抗rEg-BAG3 IgG或兔抗rEg-EB1 IgG(1∶400稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG(1∶1 000稀釋)或山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，然后根據(jù)Metal Enhanced DAB Substrate Kit(20×)說(shuō)明加入顯色液避光顯色至條帶出現(xiàn)，加入雙蒸水終止反應(yīng)。

1.8 免疫熒光定位

原頭蚴、育囊、不育囊及45日齡成蟲(chóng)在4%多聚甲醛中固定24 h后，制成石蠟切片(5 μm)，切片進(jìn)行脫蠟復(fù)水后在0.01 mol·L枸櫞酸緩沖液中95 ℃加熱20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，隨后在組織上滴加5%山羊血清并于37 ℃孵育1 h，對(duì)組織上的非特性位點(diǎn)進(jìn)行封閉。在組織上滴加兔陰性血清、兔抗rEg-BAG3 IgG或兔抗rEg-EB1 IgG(1∶400稀釋)，于4 ℃孵育過(guò)夜。第二天經(jīng)PBS清洗3次后加入FITC conjugated goat anti-rabbit IgG(H+L)(1∶2 000稀釋)避光孵育1 h，PBS清洗3次后加入DAPI染液染色3～5 min，再次清洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片，并利用熒光顯微鏡采集圖像并拍照。

1.9 H2O2誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡及Eg-BAG3、Eg-EB1轉(zhuǎn)錄水平的變化

將新鮮采集的原頭蚴利用無(wú)菌PBS清洗3次后，利用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行染色，確保原頭蚴存活率大于95%。隨后，將原頭蚴加入含10%胎牛血清、100 U·mL青霉素、100 μg·mL硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整數(shù)目為約3 000個(gè)·mL,按照每孔3 mL原頭蚴懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板并置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。原頭蚴分為處理組(T group)和空白組(NC group)，每組3個(gè)重復(fù)，24 h后處理組加入10 mmol·LHO處理8 h，對(duì)照組加入等體積PBS,以處理前作為0 h, 分別于處理后2、4、6及8 h收集原頭蚴并通過(guò)光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡對(duì)原頭蚴形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，同時(shí)，利用qRT-PCR對(duì)Eg-BAG3和Eg-EB1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，以(NCBI登錄號(hào)：XM_024497550.1)為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物：Eg-BAG3上下游引物：5′-AGATGGTCAGGACAGCGTTC-3′和5′-GAGGTGTCTTCAACCGCATT-3′；Eg-EB1上下游引物：5′-GTATGGCCACTGCCAGAAAG-3′和5′-CTCCTCCAGCTTGGTCTTTG-3′；上下游引物: 5′-ATGGTTGGTATGGGACAAAAGG-3′和5′-TTCGTCACAATACCGTGCTC-3′。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s；兩步法擴(kuò)增95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解95 ℃ 5 s，56 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s，反應(yīng)結(jié)束后結(jié)果采用2-ΔΔC法分析。

1.10 原頭蚴Eg-BAG3和Eg-EB1基因RNA干擾分析

為了進(jìn)一步探究Eg-BAG3和Eg-EB1在調(diào)控HO誘導(dǎo)的原頭蚴細(xì)胞凋亡中可能起到的作用，本研究首先通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染原頭蚴的方式抑制Eg-BAG3和Eg-EB1在原頭蚴中的表達(dá)水平。根據(jù)Eg-BAG3和Eg-EB1基因序列，利用在線軟件siRNA Target Finder針對(duì)兩個(gè)基因序列的3個(gè)不同區(qū)域，分別設(shè)計(jì)出3對(duì)特異性的siRNA，同時(shí)設(shè)計(jì)1對(duì)與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)任何基因均無(wú)關(guān)的siRNA作為陰性對(duì)照。此外，每段引物的3′末端均添加TT以增強(qiáng)siRNA的穩(wěn)定性，陰性對(duì)照siRNA的5′末端還添加FAM熒光標(biāo)記，用于檢測(cè)siRNA的轉(zhuǎn)染效率，具體序列如表1所示。將原頭蚴分為8個(gè)組，分別是6個(gè)不同siRNA試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組(siRNA-CON)以及空白對(duì)照組(不做任何處理)，每組3個(gè)重復(fù)孔，每孔3 mL培養(yǎng)基，約含原頭蚴4 000個(gè)。向500 pmol siRNA中加入25 μL RPMI1640培養(yǎng)基，制成siRNA稀釋液，然后取10 μL轉(zhuǎn)染試劑Entranster-R4000加入15 μL RPMI1640培養(yǎng)基，充分混勻，制成終體積為25 μL的轉(zhuǎn)染試劑稀釋液，將25 μL轉(zhuǎn)染試劑稀釋液和25 μL siRNA稀釋液充分混勻后全部加入到含有2.45 mL完全培養(yǎng)基的原頭蚴中，放于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后更換新的培養(yǎng)液按照上述步驟再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取不同視野，分別計(jì)數(shù)其中帶有和不帶有熒光標(biāo)記的原頭蚴估算轉(zhuǎn)染效率。離心收集蟲(chóng)體，提取蟲(chóng)體總RNA并合成cDNA，利用qRT-PCR對(duì)Eg-BAG3和Eg-EB1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析從而篩選出干擾效率最高的siRNA。

表1 siRNAs序列

將干擾效率最高的siRNA處理后的原頭蚴(BAG3-IG及EB1-IG)、未干擾組(NIG)原頭蚴(僅轉(zhuǎn)染siRNA-CON)利用10 mmol·LHO于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中作用8 h，空白對(duì)照組(NCG)原頭蚴既不經(jīng)siRNA處理，也不經(jīng)HO處理，同樣于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，隨后收集所有組的原頭蚴并制作石蠟切片(4 μm)。根據(jù)dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling, TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明對(duì)組織進(jìn)行標(biāo)記，并加入DAPI染液作用3～5 min對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，PBS清洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。隨后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取400倍鏡下的3個(gè)視野對(duì)切片進(jìn)行拍照，并應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。其中綠色熒光細(xì)胞被判定為陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為DAPI染色后的細(xì)胞核，將每張照片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)后，按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%計(jì)算出原頭蚴細(xì)胞凋亡率。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Eg-BAG3 和Eg-EB1的擴(kuò)增與生物信息學(xué)分析

Eg-BAG3 和Eg-EB1基因編碼序列全長(zhǎng)分別為699和759 bp，無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)且主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示Eg-BAG3有1個(gè)位于N端的WW結(jié)構(gòu)域(aa 7―41)和1個(gè)位于C端的BAG結(jié)構(gòu)域(aa 125―202)，Eg-EB1有1個(gè) BAR(Bin/Amphiphysin/Rvs，BAR)結(jié)構(gòu)域(aa 19―252)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示Eg-BAG3主要是無(wú)規(guī)則卷曲，其次是α螺旋和β折疊(圖1a)，Eg-EB1二級(jí)結(jié)構(gòu)則以α螺旋為主，無(wú)規(guī)則卷曲和β折疊則較少(圖1b)。通過(guò)與其他物種BAG3和EB1的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，Eg-BAG3 在不同物種之間具有較高的變異性，僅與多房棘球絳蟲(chóng)()BAG3的相似性最高(95.69%)，而與其他絳蟲(chóng)如微口膜殼絳蟲(chóng)()BAG3的相似性較低，僅為49.16%，與日本血吸蟲(chóng)()和曼氏血吸蟲(chóng)()BAG3的相似性則更低，均小于30%(圖1a)。Eg-EB1在物種之間的保守性較高，尤其是絳蟲(chóng)，Eg-EB1與多房棘球絳蟲(chóng)()、亞洲帶絳蟲(chóng)()、牛帶絳蟲(chóng)()、豬帶絳蟲(chóng)()EB1的相似性均高達(dá)70%以上，而與吸蟲(chóng)EB1的相似性相對(duì)較低(圖1b)。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，Eg-BAG3和Eg-EB1均與多房棘球絳蟲(chóng)()、亞洲帶絳蟲(chóng)()、微口膜殼絳蟲(chóng)()的BAG3或EB1屬于同一分支，具有較近的親緣關(guān)系，而與其他吸蟲(chóng)、線蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物的BAG3或EB1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。

GenBank accession numbers：Echinococcus granulosus BAG3(CDS17299.1); Echinococcus multilocularis BAG3(CDS42338.1); Hymenolepis microstoma BAG3(CDS26401.1); Schistosoma mansoni BAG3(XP_018645045.1); Schistosoma japonicum BAG3(AAP06461.1); Echinococcus granulosus EB1(CDS21096.1); Echinococcus multilocularis EB1(CDS38179.1); Taenia asiatica EB1(ANC29539.1); Taenia saginata EB1(ANC29539.1); Taenia solium EB1(AEF14021.1); Hymenolepis microstoma EB1(CDS27698.1); Schistosoma mansoni EB1(XP_018647699.1); Schistosoma japonicum EB1(CAX70483.1); Clonorchis sinensis EB1(GAA56152.1)

圖2 Eg-BAG3(a)和Eg-EB1(b)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 rEg-BAG3和rEg-EB1的表達(dá)、純化及免疫印跡

rEg-BAG3和rEg-EB1均成功表達(dá)于BL21(DE3)中，蛋白分子大小分別約為 30 ku(圖3a)和46 ku(圖3b)，大小與預(yù)期相符且二者都以上清形式存在。免疫印跡結(jié)果顯示，rEg-BAG3和rEg-EB1都可以被自然感染細(xì)粒棘球蚴綿羊的陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，而與健康綿羊陰性血清不反應(yīng)，說(shuō)明Eg-BAG3和Eg-EB1都具有較好的免疫反應(yīng)性；兔抗rEg-BAG3 IgG和兔抗rEg-EB1 IgG分別可以特異性識(shí)別rEg-BAG3和 rEg-EB1，但無(wú)法識(shí)別rBs-Tpx，說(shuō)明兔抗rEg-BAG3 IgG和rEg-EB1 IgG僅可以和rEg-BAG3及rEg-EB1特異性結(jié)合，而與其他蛋白不反應(yīng)。此外，兔抗rEg-BAG3 IgG和兔抗rEg-EB1 IgG在原頭蚴總蛋白中特異性識(shí)別出天然蛋白Eg-BAG3和Eg-EB1，大小分別約為26和29 ku(圖3)，表明Eg-BAG3和Eg-EB1表達(dá)于原頭蚴中且可能參與調(diào)控原頭蚴的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

表2 Eg-BAG3 和Eg-EB1基本分子特征分析

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品；1.IPTG誘導(dǎo)后rEg-BAG3/rEg-EB1的表達(dá)；2.純化后的rEg-BAG3/rEg-EB1；3.兔抗rEg-BAG3 IgG/rEg-EB1 IgG識(shí)別rEg-BAG3/rEg-EB1；4.兔陰性血清識(shí)別rEg-BAG3/rEg-EB1；5.兔抗rEg-BAG3 IgG/兔抗rEg-EB1 IgG識(shí)別rBs-Tpx；6.自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽(yáng)性血清識(shí)別rEg-BAG3/rEg-EB1；7.健康綿羊陰性血清識(shí)別rEg-BAG3/rEg-EB1；8.兔抗rEg-BAG3 IgG/rEg-EB1 IgG識(shí)別原頭蚴粗蛋白

2.3 免疫熒光定位

Eg-BAG3和Eg-EB1在原頭蚴、成蟲(chóng)、育囊與不育囊的免疫熒光定位分析顯示Eg-BAG3在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有分布，且主要分布于生發(fā)層以及原頭蚴和成蟲(chóng)的皮層和實(shí)質(zhì)組織(圖4a)。Eg-EB1主要分布于原頭蚴的皮層、頂突和吸盤(pán)以及包囊生發(fā)層，但在成蟲(chóng)未見(jiàn)特異性分布(圖4b)。

LL.角質(zhì)層；GL.生發(fā)層；Teg.皮層；PR.實(shí)質(zhì)組織；S.吸盤(pán)；R.頂突。標(biāo)尺：50 μm

2.4 H2O2誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡及Eg-BAG3、Eg-EB1轉(zhuǎn)錄水平的變化

在利用10 mmol·LHO連續(xù)作用原頭蚴8 h后，原頭蚴形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)明顯的凋亡相關(guān)的變化，光學(xué)顯微鏡下HO處理組原頭蚴頭節(jié)出現(xiàn)腫脹、塌陷甚至破裂的現(xiàn)象，原頭蚴體積縮小、鈣顆粒變小或模糊不清(圖5 d)，而空白組原頭蚴結(jié)構(gòu)仍舊清晰、完整，鈣顆粒清亮而明顯(圖5a)。透射電鏡結(jié)果顯示HO處理組原頭蚴細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡相關(guān)變化，如胞體變小、皺縮，染色質(zhì)凝集，甚至出現(xiàn)細(xì)胞核破裂等變化(圖5e、f)，而空白組原頭蚴細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常(圖5b、c)。qRT-PCR結(jié)果顯示，處理組原頭蚴Eg-BAG3的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平隨著HO處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，在6和8 h的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平與0 h相比，差異顯著(<0.05)(圖6a)。Eg-EB1的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平也隨著HO處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，在8 h的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平與0 h相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(<0.05)(圖6b)?？瞻捉M原頭蚴在0～8 h的Eg-BAG3和Eg-EB1相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)顯著差異(>0.05)。綜上，提示Eg-BAG3和Eg-EB1可能均參與調(diào)控HO誘導(dǎo)的原頭蚴細(xì)胞凋亡。

a.光學(xué)顯微鏡下的空白組原頭蚴(10×)；b、c.透射電鏡下的空白組原頭蚴；d.光學(xué)顯微鏡下的H2O2處理組原頭蚴(10×)；e、f.透射電鏡下的H2O2處理組原頭蚴。箭頭代表原頭蚴細(xì)胞凋亡的典型變化

數(shù)據(jù)為三次試驗(yàn)的每組0 h和其他時(shí)間點(diǎn)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異用One-way ANOVA分析來(lái)確定(*.P<0.05)

2.5 原頭蚴Eg-BAG3和Eg-EB1 RNA干擾分析

為了進(jìn)一步探究Eg-BAG3和Eg-EB1在HO誘導(dǎo)的原頭蚴細(xì)胞凋亡中起到的具體作用，本研究分別以3對(duì)針對(duì)Eg-BAG3或Eg-EB1不同位點(diǎn)區(qū)域的siRNA以及無(wú)關(guān)siRNA通過(guò)浸染法轉(zhuǎn)染原頭蚴，通過(guò)siRNA上帶有的FAM熒光標(biāo)記在熒光顯微鏡下估算轉(zhuǎn)染效率約為60%，說(shuō)明成功將siRNA導(dǎo)入了原頭蚴體內(nèi)。qRT-PCR結(jié)果顯示，針對(duì)Eg-BAG3的3對(duì)siRNA干擾組原頭蚴(BAG-108、BAG-181和BAG-486)的Eg-BAG3相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均降低，分別為siRNA-CON組原頭蚴的52.24%、32.68%和57.57%；針對(duì)Eg-EB1的3對(duì)siRNA干擾組原頭蚴(EB-91、EB-360和EB-476)的Eg-EB1的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平也都降低，分別為siRNA-CON組原頭蚴的39.87%、66.59%和64.62%，表明BAG-181和EB-91的干擾效率最高。通過(guò)進(jìn)一步利用HO處理干擾效率最高的siRNA轉(zhuǎn)染后的原頭蚴,并應(yīng)用TUNEL法對(duì)原頭蚴細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示Eg-BAG3干擾組原頭蚴細(xì)胞凋亡率(72.68%±10.00%)顯著高于未干擾組(63.87%±6.10%)，<0.05，而Eg-EB1干擾組原頭蚴細(xì)胞凋亡率(50.43%±9.14%)低于未干擾組(63.87%±6.10%)，<0.05(表3，圖7)。值得注意的是，未干擾組原頭蚴的總細(xì)胞數(shù)相對(duì)于空白組及Eg-BAG3和Eg-EB1干擾組較少，可能是由于蟲(chóng)體在制作石蠟切片時(shí)，各組蟲(chóng)體不同切面的細(xì)胞數(shù)不同引起的。

表3 TUNEL法測(cè)定原頭蚴細(xì)胞凋亡率

a.空白組原頭蚴；b.未干擾組原頭蚴；c.Eg-BAG3干擾組原頭蚴；d.Eg-EB1干擾組原頭蚴

3 討 論

BAG3屬于BAG蛋白家族，該蛋白家族成員的基本特征是在C末端存在保守的 BAG 結(jié)構(gòu)域且該結(jié)構(gòu)域可形成3個(gè)平行的短α螺旋結(jié)構(gòu)，此外，某些BAG蛋白還有WW結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸的PXXP結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)、泛素樣(ubiquitin-like，UBL)結(jié)構(gòu)域，其中WW結(jié)構(gòu)域僅見(jiàn)于BAG3蛋白。Eg-BAG3含有1個(gè)BAG結(jié)構(gòu)域和1個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，且BAG結(jié)構(gòu)域形成3個(gè)明顯的短α螺旋結(jié)構(gòu)，表明Eg-BAG3具有BAG蛋白家族的基本結(jié)構(gòu)特征。BAG蛋白正是通過(guò)這些結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)分子蛋白相互作用，從而參與調(diào)控各種生理活動(dòng)，目前,已被研究證實(shí)BAG蛋白可以通過(guò)BAG結(jié)構(gòu)域和HSP70的ATP酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而作為HSP70的共分子伴侶調(diào)節(jié)多種生理活動(dòng)，如細(xì)胞凋亡、自噬、遷移、黏附等。內(nèi)吞蛋白B1由位于N端的BAR結(jié)構(gòu)域，中間的可變區(qū)以及C端的SH3(SRC homology-3)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中，BAR結(jié)構(gòu)域具有綁定磷脂雙分子層并使膜彎曲的特性，參與囊泡的形成；SH3結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合多種內(nèi)吞蛋白，在細(xì)胞內(nèi)吞方面起到重要的調(diào)控作用。從結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析結(jié)果來(lái)看，Eg-EB1含典型的BAR結(jié)構(gòu)域,但缺少SH3結(jié)構(gòu)域，具體原因目前尚不清楚。免疫熒光定位顯示，Eg-BAG3廣泛分布于細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的各個(gè)發(fā)育時(shí)期，包括原頭蚴、成蟲(chóng)以及包囊生發(fā)層，提示Eg-BAG3可能在蟲(chóng)體的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均扮演重要角色。Eg-EB1在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)中曾被鑒定為一個(gè)大小約為29 ku的抗原分子(P-29)，且主要定位于原頭蚴的皮層和頂突以及包囊生發(fā)層，但在包囊液或成蟲(chóng)提取物中不存在。同樣，Eg-EB1在本研究也被發(fā)現(xiàn)主要定位于原頭蚴皮層、頂突以及包囊生發(fā)層，而在成蟲(chóng)則未見(jiàn)分布，推測(cè)Eg-EB1可能主要參與調(diào)節(jié)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)階段的生長(zhǎng)發(fā)育。

細(xì)粒棘球蚴包囊可以在中間宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存在并產(chǎn)生大量原頭蚴，在此過(guò)程中宿主調(diào)動(dòng)自身的免疫系統(tǒng)，通過(guò)各種免疫細(xì)胞的直接或者間接作用攻擊蟲(chóng)體，其中，宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一個(gè)重要的可以有效誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡的物質(zhì)。ROS包括過(guò)氧化氫(HO)、超氧陰離子自由基(O)、羥基自由基(-OH)等代謝產(chǎn)物，高濃度的ROS將嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，從而引起細(xì)胞凋亡，目前，HO已被用于誘導(dǎo)多房棘球絳蟲(chóng)和細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道顯示，BAG3具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，當(dāng)細(xì)胞受到活性氧等多種外界因素刺激時(shí)，BAG3將被激活，表達(dá)量顯著上升，細(xì)胞凋亡被抑制，而當(dāng)BAG3的表達(dá)受到抑制時(shí)，細(xì)胞凋亡將增加；在人骨肉瘤細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞中，BAG3可以阻止IKK-γ進(jìn)入蛋白酶體依賴的蛋白降解途徑，維持NF-κB的持續(xù)激活從而促進(jìn)細(xì)胞存活；在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，BAG3可以將BAX蛋白保留在細(xì)胞質(zhì)中，阻止其在線粒體外膜上形成孔道，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用；在人髓系U937細(xì)胞中，BAG3蛋白表達(dá)水平的下調(diào)將顯著促進(jìn)DEM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究中，HO被用于誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡，HO處理后原頭蚴體內(nèi)Eg-BAG3的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平隨著HO處理時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上調(diào)，且在利用siRNA抑制Eg-BAG3表達(dá)水平后，原頭蚴細(xì)胞凋亡率相對(duì)于未干擾組原頭蚴而言顯著上調(diào)，這表明抑制Eg-BAG3基因的表達(dá)將會(huì)促進(jìn)原頭蚴細(xì)胞凋亡，即Eg-BAG3具有抗凋亡作用。EB1蛋白作為Bax蛋白的激活因子，研究發(fā)現(xiàn)其可能具有促凋亡作用，如在HeLa 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EB1能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而下調(diào)EB1的表達(dá)則可以抑制細(xì)胞色素C的釋放從而抑制細(xì)胞凋亡；在前列腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EB1可以顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。在本研究中Eg-EB1的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平隨著HO處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著上調(diào)，且在利用siRNA抑制Eg-EB1表達(dá)水平后，原頭蚴細(xì)胞凋亡率相對(duì)于未干擾組原頭蚴而言顯著降低，意味著抑制Eg-EB1的表達(dá)將會(huì)抑制原頭蚴細(xì)胞凋亡，即Eg-EB1具有促凋亡作用。

不育囊的產(chǎn)生是細(xì)粒棘球蚴存在的一種獨(dú)特的生物學(xué)現(xiàn)象，目前研究發(fā)現(xiàn)不育囊的形成是多種因素共同作用下的結(jié)果，包括宿主的種類、年齡、生活環(huán)境、包囊在宿主體內(nèi)的寄生部位、基因型及宿主免疫反應(yīng)等，此外也有研究報(bào)道細(xì)胞凋亡可能與不育囊形成之間有著密切聯(lián)系。研究人員通過(guò)TUNEL分析和瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)不育囊生發(fā)層中的DNA片段化水平顯著高于可育囊，且不育囊生發(fā)層中caspase 3的酶活性也高于可育囊，提示細(xì)胞凋亡可能是誘導(dǎo)不育囊形成的原因之一；此外，相比于可育囊生發(fā)層而言，不育囊生發(fā)層表現(xiàn)出更嚴(yán)重的DNA氧化損傷，而且不育囊生發(fā)層中凋亡相關(guān)配體如TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)及Fas-L的表達(dá)水平顯著高于可育囊。鑒于細(xì)胞凋亡與細(xì)粒棘球蚴不育囊形成之間的密切聯(lián)系，且原頭蚴細(xì)胞來(lái)源于生發(fā)層細(xì)胞，Eg-BAG3和Eg-EB1分別對(duì)原頭蚴細(xì)胞凋亡起著抑制和促進(jìn)作用，因此Eg-BAG3和Eg-EB1也可能參與調(diào)控生發(fā)層細(xì)胞的凋亡，從而進(jìn)一步調(diào)控不育囊的形成。

4 結(jié) 論

Eg-BAG3和Eg-EB1分別屬于典型的BAG蛋白和內(nèi)吞蛋白。Eg-BAG3廣泛分布于蟲(chóng)體的各個(gè)發(fā)育階段，而Eg-EB1僅分布于原頭蚴和包囊生發(fā)層，成蟲(chóng)無(wú)分布，提示二者可能在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起不同的作用。Eg-BAG3和Eg-EB1在HO誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡的過(guò)程中轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，當(dāng)二者表達(dá)被抑制后，Eg-BAG3干擾組原頭蚴細(xì)胞凋亡率明顯上升，而Eg-EB1干擾組原頭蚴細(xì)胞凋亡率下降，表明Eg-BAG3和Eg-EB1在HO誘導(dǎo)的原頭蚴細(xì)胞凋亡過(guò)程中分別起著抗凋亡和促凋亡作用，且二者可能進(jìn)一步參與調(diào)控不育囊的形成。