李永強(qiáng) 黃奕 周雪艷 趙亮娟 呂軍影

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧市 530021

系統(tǒng)性硬化癥(SSc)是一種自身免疫性風(fēng)濕性疾病，其主要特征是機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的多系統(tǒng)結(jié)締組織纖維化。間質(zhì)性肺疾病(ILD)是SSc患者的常見并發(fā)癥，是患者最常見的死亡原因，患者預(yù)后差[1]。系統(tǒng)性硬化相關(guān)性ILD(SSc-ILD)的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，非選擇性免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、霉酚酸酯和硫唑嘌呤是臨床治療SSc-ILD患者的常用藥物[1]。一些研究結(jié)果[2-3]顯示，活血化瘀中藥治療能較好地改善機(jī)體的肺纖維化，其中紅花是最常用的活血化瘀藥物之一。本課題組的前期研究結(jié)果顯示，紅花水煎液能明顯降低SSc小鼠肺組織的羥脯氨酸含量，具有很好的抗肺纖維化作用[4]。博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠的典型特征是皮膚和肺組織發(fā)生明顯的病理學(xué)改變，皮膚真皮顯著增厚、硬化，伴肺組織Ⅰ型膠原(COLI)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)過度表達(dá)，與人類SSc患者的組織學(xué)特征非常相似[5-7]。為探討紅花水提液的抗纖維化作用機(jī)制，本研究觀察了紅花水提液對博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠肺組織COLI、α-SMA表達(dá)水平等的影響。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 24只7周齡近交系BALB/C小鼠，SPF級，雌性，體重(20±2)g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2019-0004。小鼠在廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心室溫20～25℃、相對濕度50%～70%的清潔環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，光/暗12h循環(huán)；小鼠可自由獲取食物和水。本實驗方案及操作經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗委員會審查批準(zhǔn)，符合實驗動物倫理學(xué)要求。

1.2 主要藥物和試劑 (1)將注射用鹽酸博來霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)溶于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，制成200 μg/mL緩沖液，過濾除菌后分裝于EP管中，4℃保存?zhèn)溆谩?2)將中藥紅花(批號190701921，產(chǎn)地四川，購自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房)采用常規(guī)方法加水煎煮并濃縮成1 g/mL的紅花水提液，使用純水配制成濃度為0.15 g/mL的使用液，4℃保存?zhèn)溆谩?3)RNAwait(非凍型組織RNA保存液)購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗小鼠COLI多克隆抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司，兔抗小鼠α-SMA抗體購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器 Olympus正置四色熒光顯微鏡(型號：BX53)； StepOneTM熒光定量 PCR 儀；Centrifuge 5417C高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；JY300E通用電泳儀(北京君意)；NanoDrop2000c(Thermo Scientific)。

1.4 方法 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、模型組、紅花干預(yù)組，每組8只。參照文獻(xiàn)[8]剃去各組小鼠背部中央?yún)^(qū)相同部位面積約2 .0 cm×2.0 cm的被毛，對照組小鼠在背部脫毛區(qū)皮下注射PBS 0.1 mL，1次/d；模型組、紅花干預(yù)組小鼠在背部脫毛區(qū)皮下注射博來霉素磷酸鹽緩沖液(200 μg/mL)0.1 mL，1次/d，三組小鼠均連續(xù)注射28 d。紅花干預(yù)組小鼠從皮下注射博來霉素開始后，給予紅花使用液0.2 mL/d灌胃，連續(xù)灌胃28 d；對照組和模型組小鼠給予等容量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃28 d。干預(yù)期間，各組小鼠自由飲水進(jìn)食。干預(yù)結(jié)束后，小鼠自由飲水進(jìn)食1天，禁食不禁水1天，第3天，給所有小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉處死，取背部注射區(qū)皮膚及肺組織，一部分采用4%多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片；一部分放入EP管中，加入適量的非凍型組織RNA保存液，-80℃保存，用于q-PCR檢測。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況 比較三組小鼠干預(yù)期間的活動度、背部注射區(qū)皮膚及脫毛區(qū)毛發(fā)生長情況、反應(yīng)度、體重等。

1.5.2 皮膚和肺組織病理學(xué)檢查 取小鼠皮膚、肺組織切片行HE染色和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚和肺組織病理學(xué)改變。參照文獻(xiàn)[9]，對肺組織切片進(jìn)行肺纖維化程度評分。

1.5.3 肺組織 COLI、α-SMA表達(dá)情況 采用免疫組化SABC法檢測小鼠肺組織的COLI、α-SMA表達(dá)情況，采用Image Pro Plus軟件進(jìn)行定量分析。COLI、α-SMA蛋白陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：以胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，反之為陰性反應(yīng)；隨機(jī)選取6個高倍視野(×400)，用Image Pro Plus軟件檢測每個視野下染色區(qū)域的光密度，計算平均光密度(AOD)=累積光密度/陽性面積。

1.5.4 肺組織COLI-a1、COLI-a2、α-SMA的mRNA表達(dá)水平 參照試劑盒說明書，采用q-PCR檢測小鼠肺組織COLI-a1、COLI-a2、α-SMA表達(dá)水平。COLI-a1、COLI-a2、α-SMA的mRNA相對表達(dá)量分析采用循環(huán)數(shù)(Ct)值法(2-△△Ct法，熒光強(qiáng)度達(dá)閾值時)，即相對表達(dá)量=2-△△Ct，△Ct=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計并合成PCR引物序列。

引物序列：

COLI-a1 F(AGCACGTCTGGTTTGGAGAG)

R(GACATTAGGCGCAGGAAGGT)

COLI-a2 F(TACAACGTAGAAGGGGTGTCCT)

R(TGCAGTGGTAGGTGATGTTCTG)

α-SMA F(CCAGCCATCTTTCATTGGGATG)

R(ACAGGACGTTGTTAGCATAGAGA)

內(nèi)參基因：F(ACTCTTCCACCTTCGATGCC)

R(TGGGATAGGGCCTCTCTTGC)

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠干預(yù)期間的一般情況比較 干預(yù)過程無小鼠死亡。對照組小鼠精神好，反應(yīng)靈敏，飲水和進(jìn)食正常，體質(zhì)量增加，背部注射區(qū)皮膚輕度增厚、無硬化現(xiàn)象，脫毛區(qū)毛發(fā)生長迅速，大便軟硬適中、量正常；模型組小鼠精神差、活動性差，體質(zhì)量下降明顯，背部注射區(qū)皮膚硬化明顯，飲水進(jìn)食減少，大便干硬、量偏少；紅花干預(yù)組小鼠精神較模型組好，活動性好，脫毛區(qū)毛發(fā)有不同程度生長，體質(zhì)量輕度下降。三組小鼠的體質(zhì)量變化見圖1。

圖1 三組小鼠干預(yù)期間的體質(zhì)量變化情況比較

2.2 三組小鼠皮膚和肺組織的病理學(xué)變化情況比較 干預(yù)結(jié)束后第3天處死小鼠。對小鼠皮膚進(jìn)行HE染色和Masson染色檢查，結(jié)果顯示：(1)對照組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，可見零星散在的少量炎癥細(xì)胞。(2)模型組小鼠皮膚真皮層明顯增厚，膠原纖維明顯增粗、膨大、數(shù)量增多、排列緊密、呈均質(zhì)化改變，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，包括淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞和少許漿液，脂肪組織并入到真皮內(nèi)；皮膚附屬器萎縮，減少。(3)與對照組比較，紅花干預(yù)組小鼠皮膚真皮層增厚，少量淋巴細(xì)胞浸潤，膠原纖維排列紊亂，數(shù)量增多；與模型組比較，小鼠皮膚真皮層變薄，淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤減少，膠原纖維數(shù)量減少。見圖2、圖3。 肺組織HE染色和Masson染色檢查結(jié)果顯示：(1)對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，無明顯膠原纖維增生，可見散在的少量炎癥細(xì)胞。(2)模型組小鼠肺部結(jié)構(gòu)破壞、紊亂，肺泡間隔斷裂，肺泡內(nèi)出血，肺間質(zhì)、肺泡和支氣管壁可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，膠原纖維增厚。(3)紅花干預(yù)組小鼠肺泡間隔輕中度增厚，少量中等量炎癥細(xì)胞浸潤，膠原纖維增生。見圖4、圖5。

圖2 三組小鼠皮膚HE染色(×200， A為對照組，B為模型組，C為紅花干預(yù)組)

圖3 三組小鼠皮膚Masson染色(×200，A為對照組，B為模型組，C為紅花干預(yù)組)

圖4 三組小鼠肺組織HE染色(×200，A為對照組，B為模型組，C為紅花干預(yù)組)

圖5 三組小鼠肺組織Masson染色(×200， A為對照組，B為模型組，C為紅花干預(yù)組)

2.3 三組小鼠的肺纖維化程度評分比較 干預(yù)結(jié)束后第3天處死小鼠。對小鼠肺組織進(jìn)行HE染色和Masson染色檢查，結(jié)果顯示：模型組、紅花干預(yù)組小鼠肺纖維化程度評分顯著高于對照組，紅花干預(yù)組小鼠肺纖維化程度評分顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖6。

圖6 三組小鼠的肺纖維化程度評分比較

2.4 三組小鼠肺組織的COLI、α-SMA表達(dá)水平比較 對照組小鼠肺組織中的COLI、α-SMA呈微弱表達(dá)；模型組小鼠肺組織中的COLI、α-SMA呈強(qiáng)陽性表達(dá)；紅花干預(yù)組小鼠肺組織中的COLI、α-SMA呈中等強(qiáng)度陽性表達(dá)。見圖7、圖8。模型組、紅花干預(yù)組小鼠肺組織的COLI、α-SMA表達(dá)水平(肺組織的AOD)顯著高于對照組，紅花干預(yù)組小鼠肺組織COLI、α-SMA表達(dá)水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖7 三組小鼠肺組織COLI的表達(dá)情況(×400，A為對照組，B為模型組，C為紅花干預(yù)組)

圖8 三組小鼠肺組織a-SMA的表達(dá)情況(×400，A為對照組，B為模型組，C為紅花干預(yù)組)

表1 三組小鼠肺組織的AOD比較 (n, x±s)

2.5 三組小鼠肺組織COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表達(dá)水平比較 模型組小鼠肺組織的COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；紅花干預(yù)組小鼠肺組織的COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖9。

圖9 三組小鼠的肺組織COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

SSc-ILD被認(rèn)為是纖維化、自身免疫、炎癥和血管損傷相互作用的結(jié)果，其特征是肺組織成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增加，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生慢性呼吸衰竭或致死性肺動脈高壓[10-11]?；罨某衫w維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞是肺纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，在肺纖維化過程中，成纖維細(xì)胞被激活、增殖和分化為對細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等高度敏感的肌成纖維細(xì)胞，從而刺激細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生，細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維性蛋白如Ⅰ型和Ⅲ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等比例增高，最終發(fā)生纖維化[12-14]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是判斷肌成纖維細(xì)胞活化水平最常用的標(biāo)志物[15-17]。

目前，臨床上對SSc-ILD患者一般給予免疫調(diào)節(jié)治療，但非選擇性免疫抑制劑具有毒性，短期使用可導(dǎo)致白細(xì)胞減少和感染，而長期使用可能會導(dǎo)致不孕、發(fā)生骨髓毒性和致癌。目前所研發(fā)的針對器官組織的特異性抗纖維化藥物很少直接針對肌成纖維細(xì)胞，更多的是針對調(diào)節(jié)激活信號或細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)的藥物，因此，針對肝、腎或肺肌成纖維細(xì)胞的藥物靶向治療研究是一個新的方向[17-18]。

中藥紅花，又名刺紅花、懷紅花、草紅花和金紅花，為菊科植物紅花的干燥花，其味辛性溫，歸心、肝經(jīng)，有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效。紅花含有黃酮、生物堿、聚炔、亞精胺、甾醇、木脂素、多糖等多種成分，具有抗心肌缺血、調(diào)節(jié)血流動力學(xué)、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[19]。一些研究結(jié)果顯示，活血化瘀類中藥能較好改善患者的肺纖維化狀況，中藥紅花具有抗肺纖維化的作用[20-23]。

本研究結(jié)果顯示，紅花水提液可明顯改善SSc小鼠皮膚和肺組織的病理學(xué)狀況，減少皮膚和肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤及膠原纖維沉積，降低小鼠肺纖維化程度，提示紅花水提液具有較好的抗纖維化作用；紅花水提液可下調(diào)SSc小鼠肺組織的COLI、α-SMA表達(dá)水平以及COLI-a1mRNA、COLI-a2 mRNA、α-SMA mRNA表達(dá)水平，提示紅花水提液可能是通過降低COLI、α-SMA含量，減少肌成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的生成和堆積而發(fā)揮抗纖維化的作用。