姜芳倩，路劍飛，姚廷敬，李煊赫，孫思雨，曹易凡，孟盛雯

近年來，女性乳腺癌的發(fā)病率急劇上升，疾病負(fù)擔(dān)也日益增加，已成為全球重點公共衛(wèi)生問題[1]。雖然乳腺癌預(yù)后較差，臨床上治療乳腺癌也取得了一些進(jìn)展，如赫賽汀、吡咯替尼等靶向藥物的使用，但仍然不能滿足需求。其中最主要的原因是缺乏特異性靶點，以及患者異質(zhì)性等導(dǎo)致的治療抵抗。LSG1是一種蛋白編碼基因，參與60S大亞基的活化及核糖體生物合成[2],而研究[3]發(fā)現(xiàn)核糖體生物合成與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān),最新研究提出LSG1作為衰老癌癥治療的候選靶點，可能具有很高的潛力?；诩?xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)挖掘和分子實驗、癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)等高通量數(shù)據(jù)泛癌癥分析首次發(fā)現(xiàn)包括乳腺癌在內(nèi)的六種腫瘤中LSG1基因高表達(dá)，且不利于乳腺癌患者預(yù)后[4-5]。以上提示LSG1基因高表達(dá)，可能參與乳腺癌發(fā)生或進(jìn)展。因此提出假說：LSG1基因在乳腺癌患者中高表達(dá)與疾病進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)。本研究旨在通過QRT-PCR、WB檢測LSG1在乳腺癌患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，進(jìn)而分析其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2020年7月—2021年4月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科入院手術(shù)且術(shù)前未接受任何治療的患者術(shù)中癌組織及癌旁組織標(biāo)本，癌旁正常組織取距離腫瘤5 cm的組織。所有患者的新鮮癌組織及癌旁標(biāo)本置于試管中標(biāo)記完成后，在30 min內(nèi)放入-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存,2021年5月進(jìn)行實驗。本次研究15例女性患者的年齡在37～69歲，中位年齡53歲；絕經(jīng)前患者3例，絕經(jīng)后12例；均無家族性遺傳腫瘤病史，腫瘤大小<5 cm，均未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。收集患者基本資料，所有患者均簽署知情同意書，已獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理編號：倫科批字[2021]第278號)。

1.2 主要試劑 試劑盒購自北京艾德萊生物公司；熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；核糖核酸酶抑制劑購自北京邁瑞達(dá)科技有限公司；50倍濃度熒光定量PCR參比染料及SYBR熒光染料購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Taq酶及DL2000DNA標(biāo)記物購自北京天根生化科技有限公司；引物合成由擎科公司完成；磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天；PMSF購自阿拉丁公司；蛋白marker(14-120KD)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PVDF膜(0.45μm)由Millipore公司合成；β-actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔多抗LSG1購自三鷹公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL底物液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.3 QRT-PCR實驗方法 Trizol法提取RNA(檢測RNA濃度和純度時,A260/A280比值需在1.9～2.1之間)，按照說明書規(guī)定的反應(yīng)條件將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再進(jìn)行半定量RT-PCR檢測，最后進(jìn)行QRT-PCR檢測。PCR定量時每組設(shè)3個復(fù)孔，計算復(fù)孔的Ct平均值，按照相對定量計算公式得到相對定量結(jié)果。整體以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行引物反應(yīng)。見表1。

表1 引物序列

1.4 WB實驗方法 取6例乳腺癌患者的癌組織及其配對癌旁正常組織，液氮研碎，組織強裂解液進(jìn)行裂解，提取總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。見表2。蛋白質(zhì)變性后，制備電泳膠，進(jìn)行電泳分離、電轉(zhuǎn)移，將PVDF膜浸泡在含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)中，室溫?fù)u床，封閉2 h，PVDF膜浸泡在一抗孵育液中，4 ℃孵育，過夜。PVDF在二抗孵育液中，37 ℃下，搖床孵育2 h。最后，將ECL試劑中增強液，滴加在于PVDF膜上，充分反應(yīng)后，用X光膠片壓片后掃描，用BandScan分析膠片灰度值。

表2 蛋白質(zhì)定量 (μg/μL)

2 結(jié)果

2.1 QRT-PCR檢測結(jié)果 乳腺癌組織中LSG1的表達(dá)水平高于對照癌旁組織，但癌組織中數(shù)據(jù)波動較大，體現(xiàn)在組間標(biāo)準(zhǔn)差(誤差線)較大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。而LSG1在14例癌旁組織中的表達(dá)比較穩(wěn)定，而在癌組織中的表達(dá)呈兩端分布，出現(xiàn)兩個表達(dá)較高的值，導(dǎo)致整體上乳腺癌癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，以及數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差較高。見圖2。

圖1 LSG1在乳腺癌癌和癌旁中的mRNA表達(dá)水平

圖2 LSG1在每例患者乳腺癌癌和癌旁組織中的mRNA表達(dá)水平

2.2 WB檢測結(jié)果 由免疫印跡條帶圖可知LSG1蛋白在乳腺癌癌組織表達(dá)水平明顯高于對應(yīng)癌旁組織。見圖3。在癌旁組織中LSG1蛋白相對于β-actin蛋白表達(dá)均值為0.44，而在癌組織中均值為3.04，乳腺癌組織中LSG1蛋白表達(dá)明顯增加，且高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

注：1，3，5，7，9，11為癌旁組織，2，4，6，8，10，12為對應(yīng)癌組織圖3 癌組織與癌旁組織免疫印跡條帶圖

圖4 LSG1在乳腺癌組織和癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

乳腺癌已成為全球第一大癌，相關(guān)研究[6]發(fā)現(xiàn)其發(fā)展與核糖體生物合成相關(guān)，核糖體生物合成促進(jìn)乳腺癌的生長和增殖，同時也促進(jìn)了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)乳腺癌的侵襲[7]，靶向抑制核糖體生物合成是目前研究抑制乳腺癌進(jìn)程的熱點[8]。目前已有6種GTP酶參與核糖體的生物發(fā)生，其中LSG1和EFI1連續(xù)作用于60S核糖體亞基的最后細(xì)胞質(zhì)成熟步驟[9]，LSG1介導(dǎo)核糖體生物合成,調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程。LSG1基因即60S大亞基出核轉(zhuǎn)運GTP酶1，是一種編碼蛋白質(zhì)的基因，分布廣泛，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，具有多種生物學(xué)功能。LSG1蛋白參與細(xì)胞質(zhì)前體60S大亞基的轉(zhuǎn)運和組裝過程[10]，抑制LSG1表達(dá)可誘導(dǎo)一系列的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞和細(xì)胞衰老[3]。LSG1、BRX-1以及轉(zhuǎn)錄因子MYC1能夠共同調(diào)控擬南芥中核糖體的生成，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控作用[11]。60S大亞基能結(jié)合在Nmd3同源物(nmd3 homolog，Nmd3)、LSG1和Tif6復(fù)合體上，而Nmd3結(jié)合在LSG1則可進(jìn)一步激活LSG1的酶活性，參與60S大亞基的活化及核糖體生物合成[12]。

本次研究QRT-PCR未能得出明顯陽性結(jié)果可能與腫瘤異質(zhì)性、個體差異性等相關(guān)。乳腺癌因基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和微環(huán)境不同，導(dǎo)致不同表型和生物學(xué)行為差異，正確認(rèn)識異質(zhì)性對臨床診斷、制定方案及判斷預(yù)后很重要[13]。目前已知腫瘤內(nèi)部可能存在明顯的異質(zhì)性，瘤內(nèi)異質(zhì)性可分為三大類：遺傳、表型和微環(huán)境[14]。乳腺癌的異質(zhì)性導(dǎo)致了不同分子亞型，STO-3試驗提示，腫瘤組織內(nèi)部ER表達(dá)異質(zhì)性，是內(nèi)分泌治療敏感性的獨立預(yù)測因子，高異質(zhì)性ER+患者長期生存率明顯降低[15]。本次研究PCR檢測LSG1表達(dá)比較高的一例患者ER(2+),以及Ki-67為30%等這些因素均提示患者預(yù)后不良，而根據(jù)術(shù)后隨訪，患者2021年5月8日胸部CT提示兩肺多發(fā)小結(jié)節(jié)，轉(zhuǎn)移待排，也確實表明患者預(yù)后不良，這些都在提示LSG1基因高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。雖然本次研究QRT-PCR檢測結(jié)果在乳腺癌癌組織中波動較大，組間標(biāo)準(zhǔn)差較大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是總體表達(dá)是高于癌旁組織的，仍不可忽視這一結(jié)果。

WB檢測結(jié)果提示LSG1蛋白在乳腺癌癌組織中的表達(dá)均高于癌旁組織，而LSG1主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，抑制LSG1表達(dá)可誘導(dǎo)一系列的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞和細(xì)胞衰老[3]。實現(xiàn)復(fù)制和癌基因誘導(dǎo)的衰老反應(yīng)的兩個主要途徑是p16/視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)和p53途徑[16]，相關(guān)研究[3]證實LSG1參與RB、p53途徑可能作為衰老癌癥治療的候選靶點，而RB蛋白作為腫瘤抑制基因，RB-E2F信號通路的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞周期中的G1/S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞生長[17]，RB蛋白已被證實參與乳腺癌細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6(cyclin-dependent kinases 4 and 6，CDK4/6)信號通路[18-19]，相關(guān)CDK4/6小分子抑制劑如帕博西利、阿貝西利等已被批準(zhǔn)上市，治療轉(zhuǎn)移性激素受體陽性乳腺癌[20]。p53作為主要的抑癌基因，為異常細(xì)胞的增殖抑制劑和消除器，抑制腫瘤增長[21]，p53基因突變是人類腫瘤中如乳腺癌最常見的遺傳變化[22]，p53在乳腺癌組織中高表達(dá)而且累計越多提示乳腺癌惡性程度越高[23]。

本次研究LSG1蛋白的表達(dá)選用WB技術(shù)，明確分析了LSG1蛋白在乳腺癌癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，雖然樣本量較少，僅選用6例乳腺癌患者的癌組織及癌旁正常組織，但最后結(jié)果顯示，P值小于0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)術(shù)后隨訪，WB檢測的6例患者術(shù)后病理均為浸潤性癌，有2例三陰性乳腺癌、2例管腔B型乳腺癌、2例HER2陽性型乳腺癌，Ki-67指數(shù)均為高表達(dá)(Ki-67指數(shù)以15%為界)，其中Ki-67指數(shù)最高的一例患者為80%，是三陰性乳腺癌。6例患者中分別有1例HER2陽性乳腺癌、1例管腔B型乳腺癌腋窩淋巴結(jié)均為陽性，已根據(jù)指南進(jìn)行治療。據(jù)目前隨訪，患者未出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，5、10年的疾病無進(jìn)展生存率、總體生存率等需后續(xù)跟蹤隨訪。三陰、HER2陽性、Ki-67指數(shù)高等這些指標(biāo)均提示患者預(yù)后不良。Ki-67作為增殖活性細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)核抗原，由MKI67基因編碼[24]，可用于判別患者腫瘤程度、進(jìn)展和預(yù)后，且比其他任何預(yù)測因素都準(zhǔn)確。Ki-67可以預(yù)測早期雌激素受體陽性乳腺癌的預(yù)后，尤其在管腔B型乳腺癌中，Ki-67表達(dá)水平顯著升高[25]。Mushtaq等[26]研究提出，高Ki-67與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等病理參數(shù)顯著相關(guān)，Ki-67的高表達(dá)也與ER、PR和HER2密切相關(guān)，其中98%的HER2陽性和95%的三陰性乳腺癌患者中，Ki-67指數(shù)也顯著增高，其高表達(dá)在三陰性乳腺癌中提示預(yù)后不良。故根據(jù)文獻(xiàn)報道及本次研究，LSG1蛋白在乳腺癌癌組織中高表達(dá)，且與預(yù)后不良相關(guān)。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前并未發(fā)現(xiàn)LSG1與乳腺癌或其他惡性腫瘤相關(guān)基礎(chǔ)或臨床研究，僅查閱到LSG1與核糖體生物合成相關(guān)及在其他基礎(chǔ)領(lǐng)域方面的研究。因此本研究是第一次嘗試研究LSG1在乳腺癌中的表達(dá)，其作用不可忽視。LSG1高表達(dá)可能參與乳腺癌的增殖并提示預(yù)后較差，本次研究具有廣泛而深遠(yuǎn)的意義。

綜上，本次研究驗證了LSG1在乳腺癌癌組織中基因和蛋白水平高表達(dá)，且與患者預(yù)后不良相關(guān)，后續(xù)可通過分子實驗、動物試驗等揭示乳腺癌中LSG1基因可能參與的分子機制，使其可能作為乳腺癌診斷和治療的靶點，為新藥研制提供方向。