陳 晨，朱琴芳，徐紅星

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州 215002）

人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一種嗜人體組織細(xì)胞的DNA病毒，可廣泛感染人類皮膚、生殖道組織，引發(fā)增生性疾病，如尖銳濕疣（Condyloma acuminatum，CA），尖銳濕疣又稱生殖器疣或病毒疣，近年來(lái)其發(fā)病率有上升趨勢(shì)［1］。目前可分離200多種HPV基因亞型，與人類常見(jiàn)疾病相關(guān)的有30多種亞型，不同型別的HPV致病能力差異較大，依據(jù)HPV引起的增生性病變是否致癌，將其分為低危型和高危型，包括低危亞型6、11、42、43、44等，高 危 亞 型16、18、31、33、39、45、51、52、56、58型等［2］。為了解本地區(qū)尖銳濕疣感染年齡、性別、基因亞型等分布情況，筆者應(yīng)用流式熒光雜交技術(shù)，就383例本院皮膚科就診的尖銳濕疣患者及疑似患者進(jìn)行HPV-DNA基因亞型檢測(cè)，包括低危亞型HPV6、11、40、42、43、44、55、61、81、83十種型別，高危亞型HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82十七種型別，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 一般資料 尖銳濕疣患者及疑似患者383例來(lái)自本院皮膚科2018年8月1日至2020年1月30日的就診患者，其中男性217例，女性166例，年齡（16～70）歲，平均年齡（33.1±10.7）歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 暴露疣體的疑似尖銳濕疣患者，行常規(guī)消毒，用無(wú)菌鑷子摘取疣體組織，存放于專用保存液送檢。其余患者，女性用無(wú)菌棉拭子擦去宮頸口的分泌物，用宮頸刷旋轉(zhuǎn)4至5圈收集脫落細(xì)胞，或用無(wú)菌棉拭子于相應(yīng)皮損部位反復(fù)摩擦后取出放入保存液送檢；男性患者，也用無(wú)菌棉拭子于相應(yīng)皮損部位反復(fù)摩擦，置保存液送檢。

1.2.2 主要試劑和儀器

1.2.2.1 試劑 上海浩源生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑，上海透景生命科技股份有限公司生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒核酸分型檢測(cè)試劑（流式熒光雜交法）。

1.2.2.2 儀器 PerkinElmer Pre-NAT全自動(dòng)核酸檢測(cè)反應(yīng)體系構(gòu)建系統(tǒng)，ABI-Veriti基因擴(kuò)增儀，多功能流式點(diǎn)陣儀Luminex200。

1.2.3 檢測(cè)方法

1.2.3.1 核酸提取 采用Pre-NAT全自動(dòng)核酸檢測(cè)反應(yīng)體系構(gòu)建系統(tǒng)應(yīng)用磁珠法進(jìn)行樣本核酸提取。高濃度胍鹽將細(xì)胞或病毒蛋白外殼裂解，釋放出核酸，游離的核酸吸附到磁珠顆粒表面，洗滌去除溶液中的雜質(zhì)，最后將核酸從磁珠上洗脫下來(lái)，作為下游實(shí)驗(yàn)用模板。

1.2.3.2 流式熒光雜交方法 原理：采用通用引物多重PCR擴(kuò)增，流式熒光雜交分型檢測(cè)的方法，同時(shí)檢測(cè)27種HPV DNA。試劑盒共設(shè)置了2類探針和28顆分類微球，其中，與HPV DNA雜交的探針包被在27個(gè)分類微球上，對(duì)應(yīng)型別特異性探針的信號(hào)為陽(yáng)性將被判定為該型別HPV陽(yáng)性，質(zhì)控微球是與人β球蛋白（β-globin）基因雜交的探針，它的結(jié)果提示取樣、提取模板、PCR擴(kuò)增和雜交整個(gè)過(guò)程是否符合要求。首先PCR擴(kuò)增待檢測(cè)樣本DNA，得到的PCR產(chǎn)物與微球上交聯(lián)的探針根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理雜交，微球上相應(yīng)探針捕獲到標(biāo)有生物素（Biotin）的PCR產(chǎn)物，加入標(biāo)記了鏈霉親和素（SA）的藻紅蛋白（PE）后，形成微球-探針-PCR產(chǎn)物-Biotin-SA-PE復(fù)合物，最后在多功能流式點(diǎn)陣儀上檢測(cè)熒光信號(hào)。擴(kuò)增與雜交參數(shù)：擴(kuò)增體系為：10μl反應(yīng)液，5μl引物，0.8μl聚合酶，5μl模板；擴(kuò)增條件為：95℃ 5min、95℃ 30s、58℃ 30s、68℃ 30s擴(kuò) 增5個(gè) 循 環(huán)，95℃ 30s、55℃ 30s、68℃30s擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；雜交條件為：3μl擴(kuò)增產(chǎn)物加22μl微球混勻，95℃ 5min、48℃ 30min，加75μlLSA-PE、48℃ 15min。

結(jié)果判斷：如果PCR產(chǎn)物和探針完全配對(duì)，則在流式點(diǎn)陣儀上即可檢測(cè)到分類微球的熒光信號(hào)，信號(hào)大于等于150，結(jié)果判斷為陽(yáng)性；如果PCR產(chǎn)物和探針不配對(duì)，則分類微球的熒光信號(hào)為背景信號(hào)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尖銳濕疣患者及疑似患者年齡和性別構(gòu)成 （21～30）歲年齡段就診患者人數(shù)最多，占總?cè)藬?shù)的44.9%，其次為（31～40）歲年齡段，占30.8%，最少為＞60歲年齡段，占3.1%。就診患者男性多于女性，分別占56.7%、43.3 %，男性和女性就診人數(shù)均為（21～30）歲年齡段最多，分別占男女人數(shù)的45.2%、44.6%。＞60歲年齡段就診患者以男性為主，占該年齡段男女人數(shù)83.3%，其次為（41～50）歲，占78.4%，≤20歲年齡段就診患者以女性為主，占70%。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 383例就診患者各年齡段性別構(gòu)成

2.2 HPV總體感染及各年齡段男女患者感染率 383例就診患者HPV陽(yáng)性277例，陽(yáng)性率為72.3%，其中男性感染158例，感染率為72.8%，女性119例，感染率71.7%，男女感染率差異不顯著（χ2=0.059，P=0.807）。感染人群主要為（21～30）歲和（31～40）歲年齡段人群，感染率分別為68.6%和71.2%，（41～50）年齡段男性感染率明顯高于女性，除該年齡段外其余年齡段感染性別差異不明顯（χ2=6.286，P=0.179），男性最高感染率年齡段為＞60歲，該年齡段男性100%陽(yáng)性，女性感染率最高年齡段為（51～60）歲和＞60歲，均為100%陽(yáng)性。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 277例HPV感染患者不同性別各年齡段感染率

2.3 就診患者感染類型 多重亞型高于單一亞型感染率，分別為37.6%和34.7%，不同年齡段單一感染與多重感染存在差異（χ2=16.679，P=0.005），二重以上亞型高達(dá)18.0%；低危亞型和高低危亞型混合感染為感染主要類型，兩者感染率（29.5%和26.6%）高于高危亞型（16.2%），低危亞型及高危亞型均以單一亞型感染為主（23.5%與11.2%）。具體結(jié)果見(jiàn)表3和4 。

表3 277例HPV感染患者亞型數(shù)量與年齡段分布

2.4 檢測(cè)結(jié)果亞型 低危亞型HPV6和11為主要型別。低危型感染陽(yáng)性率排前五的是HPV6、11、81、43、55，依次為28.2%、17.0%、8.4%、5.5%、4.7%；高危型感染陽(yáng)性率排前的是HPV16/52、58、51/68，依次為7.8%、7.0%、5.7%。HPV6多重略多于單一感染例數(shù)（58 vs 50），HPV11多重感染則明顯多于單一感染例數(shù)（43 vs 22），其余各亞型也均為多重多于單一感染。從年齡結(jié)構(gòu)分析各亞型，總體上分布在（21～30）歲，其次是（31-40）歲年齡段。具體結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 277例HPV感染患者檢測(cè)結(jié)果亞型

3 討論

尖銳濕疣是臨床常見(jiàn)的生殖器疾病，主要傳播途徑是性傳播，常以亞臨床感染形式存在，隱匿性、傳染性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高，是由人乳頭瘤病毒HPV引起的增生性疾?。?-4］。HPV是直徑為50-55nm DNA病毒，具有高度的宿主專一性，由雙鏈DNA構(gòu)成，包括7900個(gè)核苷酸，所有HPV病毒的基因組結(jié)構(gòu)相似，嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交可確定病毒亞型。研究表明，HPV基因型的分布和流行存在明顯的種族和地區(qū)差異，某種型別在特定區(qū)域占主導(dǎo)地位［5-7］。因此，了解本地區(qū)尖銳濕疣患者及疑似患者中HPV感染的年齡、型別等對(duì)流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

表4 277例HPV感染患者高危與低危型感染情況

門診就診尖銳濕疣患者及疑似患者的年齡和性別分布情況分析表明，就診患者在（21～30）歲年齡段為峰值（44.9%），隨年齡增長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)（除外20歲及以下年齡段患者），與阮建波等結(jié)果一致［8］。就診患者性別為男性多于女性，就各年齡段男女比例分析，基本為隨年齡增加男性患者比例增加，60歲年齡段達(dá)83.3%；女性患者隨年齡增加而減少，20歲及以下患者有70%為女性，應(yīng)引起足夠重視。有關(guān)就診患者男女比例問(wèn)題，未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。

本次研究中，對(duì)總體感染率及各年齡段及男女各自的感染率進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，總體感染率男性與女性（72.8% vs 71.7%）經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異。最高感染年齡段為（21～30）歲、（31～40）歲，合計(jì)感染率為72.9%，即以青年人為主要感染人群，與王穩(wěn)等報(bào)道（21～30）歲檢出數(shù)最多一致［9］。50歲以上的高年齡患者盡管就診患者數(shù)少（36例），但共有35例陽(yáng)性患者，該年齡段的感染率高達(dá)97.2%，即高年齡就診患者一旦接觸病毒，就有極高感染風(fēng)險(xiǎn)，可能與其免疫功能差有一定相關(guān)［10-11］。對(duì)該類人群，應(yīng)做好宣傳，避免直接或間接接觸。

分析本組患者的單一和多重感染結(jié)果表明，277例感染者中，多重感染比例高于單一感染比例（52.0% vs 48.0%）。馬貴濤［12］等報(bào)道，女性尖銳濕疣患者HPV單一感染60.51%多于多重感染39.49%，可能與單純分析女性人群有關(guān)。同時(shí)，多重感染中二重感染比例與三重及以上感染比例基本各占一半，最多高達(dá)七重感染，分析其原因，可能尖銳濕疣患者因復(fù)發(fā)而導(dǎo)致不同亞型的感染。文獻(xiàn)報(bào)道，尖銳濕疣患者存在細(xì)胞免疫功能異常，導(dǎo)致HPV發(fā)生免疫逃逸，從而引起反復(fù)感染［13-15］。從低危和高危亞型感染分析，本研究結(jié)果中，尖銳濕疣患者的感染以單純低危和高低?；旌细腥緸橹?，分別占HPV感染患者感染類型的40.8%和36.8%，剩余22.4%為單純高危亞型感染，說(shuō)明HPV低危亞型是尖銳濕疣患者的主要病原體［16］，但相當(dāng)一部份人群?jiǎn)渭兏腥靖呶喰?，故針?duì)尖銳濕疣患者，應(yīng)進(jìn)行HPV高低危分型檢測(cè)，而不能僅檢測(cè)HPV低危亞型。

文獻(xiàn)報(bào)道，女性宮頸HPV亞型感染存在地域差異［17-20］。本文感染亞型結(jié)果分析顯示，HPV6、HPV11是尖銳濕疣感染的主要型別，其次是HPV81、HPV16、HPV52。大連王穩(wěn)等報(bào)道感染亞型前五依次為HPV11、HPV6、HPV16、HPV52、HPV53/58，廣東馬貴濤［12］等報(bào)道主要感染型別依次為HPV11、HPV6、HPV43、HPV16、HPV52/58，與本文結(jié)果有區(qū)別，故尖銳濕疣患者HPV感染存在地域差異，包括主要感染型別不同、陽(yáng)性率不同及感染年齡段差異。