包麗麗，孫傳凱，李曉玫，任向宇，殷兆麗，孫曉琳，福泉，納仁高娃

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050

Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）作為固有免疫識(shí)別受體，在識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）和激活免疫應(yīng)答中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［1］。TLR 是由結(jié)合和識(shí)別PAMPs的胞外結(jié)構(gòu)域及與白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）受體胞質(zhì)區(qū)同源的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成［2］。目前，已發(fā)現(xiàn)人體存在的TLR 家族有10 個(gè)亞型（TLR1～TLR10）［3］，其中TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 定位在胞內(nèi)，可識(shí)別病毒的DNA 或RNA；TLR1、TLR2、TLR4、TLR5 和TLR6 表達(dá)于細(xì)胞表面，識(shí)別胞外細(xì)菌和真菌的細(xì)胞壁成分及一些病毒蛋白［3-4］。TLR2 可在與黏膜免疫和耐受相關(guān)的細(xì)胞上表達(dá)，包括腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs）、樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞［5］。有研究表明，TLR2 可識(shí)別細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁成分［6-7］，但必須與TLR1、TLR6 結(jié)合形成異源二聚體，即TLR1／2 和TLR2／6，這兩種TLR2 異源二聚體通過(guò)MyD88 依賴(lài)的信號(hào)通路導(dǎo)致NF-κB 的轉(zhuǎn)錄激活［8-9］。也有研究表明，TLR2 在心血管疾病、風(fēng)濕免疫性疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后均有一定作用［10］。

miRNA 是一種內(nèi)源性、非編碼小分子RNA，通過(guò)抑制表達(dá)或降解mRNA 的方式參與調(diào)控宿主的多種生理和病理過(guò)程，其與靶mRNA 3′非編碼區(qū)（3′UTR）相結(jié)合，可抑制mRNA 的轉(zhuǎn)錄后翻譯過(guò)程［11］。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 可靶向結(jié)合TLR23′ UTR 區(qū)，通過(guò)調(diào)控TLR2 影響其下游信號(hào)通路及免疫反應(yīng)，在不同程度上改變機(jī)體對(duì)病原的抵抗能力，從而影響多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后［12-13］，但相關(guān)作用機(jī)制尚未明確。因此本研究采用PCR 突變技術(shù)構(gòu)建TLR23′UTR 野生型和突變型重組質(zhì)粒，以期為T(mén)LR2功能的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株 293T 細(xì)胞購(gòu)自ATCC；載體pmiR-RB-REPORTTM購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；感受態(tài)E.coli DH5α 由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 DNA 純化回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ及DNA 連接酶均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；DL2000 DNA marker 購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中登錄的TLR2 mRNA 的全序列（NM_003264.3），應(yīng)用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)野生型TLR23′UTR 的引物，野生型上游引物（F-w）：5′-GGCGGCTCGAGGATAAAGTCCTAGGTTCCCAT-3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物（R-w）：5′-AATGCGGCCGCAGA-CAGATCCAGATCACAT-3′（下劃線部分為NotⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增產(chǎn)物大小為880 bp；根據(jù)TLR23′UTR 與miR-122的預(yù)測(cè)結(jié)合靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)突變型TLR23′ UTR 擴(kuò)增引物，突變型上游引物（F-m）：5′-ATTTGGGGGTGAGGCCAAAACTTGTTGCTATT-3′（下劃線部分為靶序列突變位點(diǎn)），下游引物（R-m）：5′-AGTTTTGGCCTCACCCCCAAATACTTTGCCTT-3′（下劃線部分為靶序列突變位點(diǎn)）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 野生型TLR23′UTR 基因片段的擴(kuò)增 用DNA質(zhì)粒提取試劑盒提取293T 細(xì)胞的基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增TLR23′UTR 基因片段。PCR 反應(yīng)體系為：5×Buffer 6 μL，dNTPs（2.5 mmol／L）2.4 μL，F(xiàn)-w／R-w（10 μmol／L）各1 μL，DNA 聚合酶（2 U／μL）0.3 μL，模板100 ng，滅菌蒸餾水補(bǔ)充體積至30 μL。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸3 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 野生型TLR23′UTR 重組質(zhì)粒的制備 TLR23′UTR 基因PCR 產(chǎn)物采用DNA 純化回收試劑盒純化，產(chǎn)物經(jīng)NotⅠ和XhoⅠ雙酶切后，與經(jīng)相同酶酶切的載體pmiR-RB-REPORTTM以DNA 連接酶于16 ℃連接30 min；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α，接種至LB（Amp+）固體培養(yǎng)板中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR 鑒定。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸3 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。將陽(yáng)性克隆送銳博生物科技有限公司（廣州）測(cè)序。

1.6 突變型TLR23′UTR 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以野生型TLR23′ UTR 質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增含突變序列的2 段序列。反應(yīng)總體系為：5 × Phusion Buffer 6 μL，dNTP mix（2.5 mmol／L）2.4 μL，F(xiàn)-w／R-m（10 μmol／L）各1 μL，DNA 聚合酶（2 U／μL）0.3 μL，DNA 模板100 ng，用滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至30 μL。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。以R-w／F-m 為引物，相同體系和條件擴(kuò)增。將擴(kuò)增的2 段突變序列經(jīng)電泳分析并純化回收后，進(jìn)行拼接，以其為模板，R-w／F-w 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.4 項(xiàng)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收，同1.5項(xiàng)方法將突變序列連接至載體pmiR-RB-REPORTTM，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α，接種至LB（Amp+）固體培養(yǎng)板中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單菌落于LB（Amp+）液體培養(yǎng)基，37 ℃搖菌約14 h；挑取單克隆送銳博生物科技有限公司（廣州）測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 野生型TLR23′UTR 基因片段的鑒定 野生型TLR23′UTR 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖分析，可見(jiàn)880 bp 的目的基因條帶，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。

圖1 野生型TLR23′UTR 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of wild type TLR23′UTR gene

2.2 野生型TLR23′UTR 重組質(zhì)粒的鑒定

2.2.1 菌落PCR 重組菌經(jīng)菌落PCR 鑒定，可見(jiàn)1000bp 的目的基因片段，大小與預(yù)期相符，見(jiàn)圖2。表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 野生型TLR23′UTR 重組菌的菌落PCR 鑒定Fig.2 Identificaton of recombinant E.coli with wild type TLR23′UTR by colony PCR

2.2.2 測(cè)序鑒定 測(cè)序結(jié)果顯示，插入序列與TLR23′UTR 序列完全一致，見(jiàn)圖3。再次證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖3 野生型TLR23′UTR 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequencing result of wild type recombinant plasmid with TLR23′UTR

2.3 突變型TLR23′UTR 重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定 測(cè)序結(jié)果表明，靶序列CACTCC 已更改為GTGAGG，見(jiàn)圖4。表明突變型TLR23′UTR 重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖4 野生型（A）及突變型TLR23′UTR 重組質(zhì)粒（B）的測(cè)序圖Fig.4 Sequencing of wild（A）and mutant（B）type recombinant plamids with TLR23′UTR

3 討論

目前，有許多miRNA 可通過(guò)與TLR23′UTR 區(qū)結(jié)合影響TLR2 的表達(dá)，發(fā)揮基因調(diào)控作用，如miR-101可靶向結(jié)合TLR2 的3′UTR 區(qū)，抑制TLR2 的表達(dá)，與風(fēng)濕性心臟病相關(guān)［14］；miR-143 下調(diào)可降低TLR2的mRNA 和蛋白的表達(dá)，并通過(guò)此途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期捕獲［15］；miR-143 還可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR2 的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［16］；miR-154 通過(guò)靶向結(jié)合TLR2 可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移［17］；TLR2 的激活可上調(diào)miR-125a-5p，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和炎癥的激活［18］。以上研究結(jié)果提示，miRNA 對(duì)TLR2的調(diào)控與多種疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。

miRNA-122 是肝臟中含量最豐富的miRNA，占總miRNA 的70%以上，在肝臟生理性發(fā)育過(guò)程中呈持續(xù)高表達(dá)，是參與肝臟生理性肝細(xì)胞分化、發(fā)育、細(xì)胞代謝和肝細(xì)胞免疫應(yīng)答及肝細(xì)胞表型等的重要miRNA，同時(shí)在肝癌的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。TLR 在調(diào)節(jié)慢性炎癥和免疫耐受方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，也參與了腫瘤的進(jìn)展和發(fā)展。TLR2 可調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子（IL-6、IL-1β 和IL-8）的產(chǎn)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［19-20］。TLR2 的激活可能會(huì)在肝細(xì)胞癌（hepatocarcinoma，HCC）癌變的早期階段減緩HCC 的起始和發(fā)展，即具有抗癌的潛能；而TLR2的激活也可能影響炎癥和纖維化的進(jìn)展，即具有促癌的潛能［21］。表明miRNA-122 和TLR2 在體內(nèi)感染的發(fā)展和控制中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TLR23′UTR 區(qū)存在與miRNA-122 靶向結(jié)合的位點(diǎn)，且二者在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，為進(jìn)一步分析二者可能的結(jié)合位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了野生型和突變型TLR23′UTR 重組質(zhì)粒，以明確miRNA-122 與TLR2 的靶向關(guān)系及其在肝癌中的作用。經(jīng)菌落PCR 鑒定及測(cè)序鑒定，表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的野生型和突變型TLR23′UTR 重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒為雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，今后會(huì)將miRNA-122 與構(gòu)建的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，可通過(guò)報(bào)告基因相對(duì)熒光值的變化來(lái)驗(yàn)證miRNA-122 與TLR23′UTR 的相互作用，更準(zhǔn)確，更直觀。本實(shí)驗(yàn)為T(mén)LR2 功能的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。