張鵬，商晨，王嚴(yán)

1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241001

呼吸道感染性疾病是臨床常見的感染性疾病之一，由病原體侵入呼吸道從而繁殖致病，尤其下呼吸道感染對(duì)人體危害更加嚴(yán)重。隨著臨床抗生素濫用，耐藥菌株明顯增多，引起下呼吸道感染的幾率日益增加，而可供臨床選用的抗菌藥物越來越少［1］。導(dǎo)致呼吸道感染的病原體主要有細(xì)菌、病毒、真菌等［2］。目前臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)仍主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)生化鑒定法，操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且陽性檢出率較低［3］。為滿足臨床診療及時(shí)性的需求，急需開發(fā)高效、準(zhǔn)確、快速的檢驗(yàn)手段進(jìn)行病原學(xué)鑒定。恒溫核酸擴(kuò)增芯片法作為近來研發(fā)的PCR 技術(shù)［4］，主要針對(duì)常見下呼吸道感染病原菌的靶基因設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，理論上具有速度快、結(jié)果準(zhǔn)確和多重病原體檢出能力的優(yōu)點(diǎn)。本研究同時(shí)應(yīng)用恒溫核酸擴(kuò)增芯片法和傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)生化法對(duì)臨床疑似呼吸道感染住院患者痰液樣本進(jìn)行檢測(cè)并比較，評(píng)價(jià)恒溫核酸擴(kuò)增芯片法在呼吸道感染性病原菌診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 478 例痰液樣本來自2019 年12月— 2020 年5 月皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科、神經(jīng)外科、呼吸內(nèi)科、血液內(nèi)科、老年醫(yī)學(xué)科、感染科、急診內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、消化內(nèi)科、心血管內(nèi)科疑似呼吸道感染住院患者，均按照臨床微生物標(biāo)本采集規(guī)范進(jìn)行樣本采集。本研究獲得皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（WF2020015）。

1.2 菌株 質(zhì)控菌株均為國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.3 主要試劑及儀器 iChip-400 四通道芯片恒溫核酸擴(kuò)增分析儀及配套的呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：01190701）購(gòu)自天津百康芯生物科技有限公司；Vitek-2 全自動(dòng)微生物鑒定儀及配套的細(xì)菌鑒定卡（批號(hào)：GN2411172403／GP2421134403）購(gòu)自法國(guó)bio-Merieux 公司。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1 恒溫核酸擴(kuò)增芯片法 樣本均經(jīng)4% NaOH痰液消化，用200 μL 核酸提取液震蕩懸浮并100 ℃金屬浴5 min；漩渦振蕩瞬時(shí)離心進(jìn)行核酸提取，70 μL 總反應(yīng)體系（35 μL 恒溫?cái)U(kuò)增試劑+ 35 μL模板DNA 溶液芯片加樣），37 ℃3 min，65 ℃47 min。檢測(cè)完成后，儀器采用二階導(dǎo)數(shù)法計(jì)算S 擴(kuò)增曲線進(jìn)入快速擴(kuò)增期的第1 個(gè)拐點(diǎn)，拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)刻與原點(diǎn)時(shí)刻的差值定義為Tp 值，根據(jù)Tp 值并結(jié)合待測(cè)樣本判斷值進(jìn)行結(jié)果判讀，判讀完成后，在熒光曲線區(qū)域顯示歸一化曲線，完成質(zhì)控和待測(cè)樣本的檢驗(yàn)。

1.4.2 微生物分離培養(yǎng)生化法 樣本經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)分純后，采用全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定，按照儀器及試劑說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 恒溫核酸擴(kuò)增芯片法病原菌鑒定結(jié)果 478 例痰液樣本共檢出病原菌312 例，陽性檢出率65.27%。單病原菌感染256 例（82.05%），混合病原菌感染56 例（17.95%），見圖1。312 例陽性樣本共檢測(cè)出10 種病原菌，前5 位分別為肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌，見表1。病原菌分布前5 位的科室分別為重癥醫(yī)學(xué)科、神經(jīng)外科、呼吸內(nèi)科、血液內(nèi)科和老年醫(yī)學(xué)科，見表2。

圖1 單病原菌和混合病原菌恒溫核酸擴(kuò)增芯片法歸一化熒光曲線Fig.1 Normalized fluorescent curve of loop-mediated isothermal amplification of single and mixed pathogens

表1 恒溫核酸擴(kuò)增芯片法檢測(cè)病原菌種類分布情況（例數(shù)，%）Tab.1 Distribution of species of pathogens detected by loopmediated isothermal amplification（case，%）

表2 病原菌來源科室分布Tab.2 Distribution of departments with pathogens detected

2.2 分離培養(yǎng)生化法病原菌鑒定結(jié)果 478 例痰液樣本共檢出病原菌165 例，陽性檢出率34.52%。單病原菌感染145 例（87.88%），混合病原菌感染20例（12.12%）。165 例陽性樣本共檢測(cè)出10 種病原菌，前5 位分別為肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌，見表3。

表3 分離培養(yǎng)生化法檢測(cè)病原菌種類分布情況（例數(shù)，%）Tab.3 Distribution of species of pathogens detected by biochemical identification in isolation and culture（case，%）

2.3 兩種方法對(duì)病原菌鑒定結(jié)果的比較 478 例痰液樣本，恒溫核酸擴(kuò)增芯片法和分離培養(yǎng)生化法分別檢出病原菌312 和165 例，經(jīng)培養(yǎng)，陽性樣本病原菌鑒定結(jié)果與核酸鑒定結(jié)果均一致。恒溫核酸擴(kuò)增芯片法病原菌檢出率顯著高于分離培養(yǎng)生化法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 90.415，P ＜0.001），而鑒定時(shí)間［（4.67 ± 2.93）h］明顯低于分離培養(yǎng)生化法［（49.87±10.27）h］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =69.24，P ＜0.001）。

3 討論

全球疾病負(fù)擔(dān)研究中心2016 年統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，呼吸系統(tǒng)感染是全世界感染性疾病發(fā)病及死亡的重要原因之一［5］，而引起下呼吸道感染最主要的病原體為細(xì)菌?，F(xiàn)階段臨床診斷細(xì)菌性肺炎仍主要依靠微生物實(shí)驗(yàn)室病原菌培養(yǎng)和生化反應(yīng)鑒定菌種這一傳統(tǒng)方法，雖然從痰液樣本中分離到菌株被公認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，檢出率低，有些病原體培養(yǎng)條件苛刻，甚至無法進(jìn)行培養(yǎng)，因此，不能滿足臨床早期診斷和治療的要求。其他一些方法如血清學(xué)檢測(cè)等，缺乏一定的靈敏度和特異性［6］。因此，臨床要求更加高效、便捷的病原菌檢測(cè)方法以用于及時(shí)診療。

2000 年，NOTOMI 等［7］報(bào)道了一種新的核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該方法針對(duì)靶基因6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異性引物，在65 ℃恒溫條件下，通過置換DNA 聚合酶完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。在此過程中無需經(jīng)過變性、退火、延伸等常規(guī)步驟，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間，反應(yīng)靈敏度和特異性也明顯提高［8］。近來環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已被應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等方的生物學(xué)檢測(cè)，同時(shí)逐漸衍變?yōu)榕R床尋找病原學(xué)證據(jù)的檢測(cè)手段［9-12］。如2019年底至2020 年初，YAN 等［13］利用逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法同時(shí)檢測(cè)60 例新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）臨床樣本的ORF1ab、S 兩種基因靶標(biāo)，結(jié)果顯示該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，全程自動(dòng)化且高效便捷，為COVID-19 的精準(zhǔn)防控做出了重要貢獻(xiàn)。

針對(duì)恒溫核酸擴(kuò)增芯片法檢測(cè)病原菌的國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本研究對(duì)478 例臨床疑似呼吸道感染住院患者痰液樣本同時(shí)進(jìn)行恒溫核酸擴(kuò)增芯片法和傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)生化法的檢測(cè)，結(jié)果顯示，恒溫核酸擴(kuò)增芯片法共檢出病原菌312 例，單病原菌感染256 例，混合病原菌感染56 例。分離培養(yǎng)生化法共檢出病原菌165 例，單病原菌感染145 例，混合病原菌感染20 例。兩種方法均共檢出10 種細(xì)菌，其中肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率較高，與李艷燕等［14］報(bào)道基本一致。兩種方法病原菌陽性檢出率比較，恒溫核酸擴(kuò)增芯片法明顯高于分離培養(yǎng)生化法（P ＜0.001），原因可能如下：①恒溫核酸擴(kuò)增芯片法屬于PCR 技術(shù)，待測(cè)樣本即使含有少量拷貝也可獲得目的基因［15］；②恒溫核酸擴(kuò)增芯片實(shí)驗(yàn)過程中，環(huán)境相對(duì)封閉，干擾因素少；③傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)周期長(zhǎng)，易受培養(yǎng)條件、人員操作等因素影響；④部分苛養(yǎng)菌本身培養(yǎng)條件苛刻，陽性率低［16］。兩種方法病原菌檢出時(shí)間比較，恒溫核酸擴(kuò)增芯片法明顯低于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)生化法（P ＜0.001）。本實(shí)驗(yàn)不足之處是研究對(duì)象僅為引起呼吸道感染的病原菌，未對(duì)常見引起呼吸系統(tǒng)感染的病毒、真菌、寄生蟲等其他病原體進(jìn)行檢測(cè)，且實(shí)驗(yàn)周期較短，在今后的臨床科研中可進(jìn)一步完善。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了從呼吸道樣本中通過恒溫核酸擴(kuò)增芯片技術(shù)直接檢測(cè)病原菌的方法，該方法敏感度高、特異性強(qiáng)，優(yōu)于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)生化鑒定法。另外，恒溫核酸擴(kuò)增芯片法檢測(cè)時(shí)間控制在約4 h，縮短了病原菌檢出時(shí)間，能夠?yàn)榕R床及時(shí)診治提供高效可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，對(duì)臨床早診斷和精準(zhǔn)治療具有重要意義。