楊英，龍瓊，楊穎，2，李多，3，楊姝，馬雁冰

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650000；2.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650000；3.云南省疾病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650000

近年，免疫療法成為腫瘤治療中的研究熱點(diǎn)，但在實(shí)體瘤內(nèi)形成免疫細(xì)胞無(wú)法到達(dá)的“免疫荒漠”使免疫療法對(duì)實(shí)體瘤的治療效果不佳［1］。溶瘤病毒是一種經(jīng)基因工程法制備而成或天然存在的病毒，可在不傷害正常組織的情況下選擇性地在癌細(xì)胞中復(fù)制并殺死癌細(xì)胞［2］，具有良好的靶向性、腫瘤殺傷能力和調(diào)節(jié)免疫的功能［3］。流感病毒屬于正黏病毒科，含有8 個(gè)單負(fù)鏈RNA 片段的包膜病毒，8 個(gè)片段分別編碼堿性聚合酶2（polymerase basic 2，PB2）、堿性聚合酶1（polymerase basic 1，PB1）、酸性聚合酶（polymerase acidic，PA）、血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nucleoprotein，NP）、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）、基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）和非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein，NS）［4］，RNA 與NP 結(jié)合形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein，RNP），病毒包膜表面含有刺突HA 和NA［5］。近年研究顯示，流感病毒具有較強(qiáng)的免疫調(diào)控能力，其基因不會(huì)整合至宿主基因組及引起慢性疾病，該病毒的減毒形式具有針對(duì)腫瘤細(xì)胞的裂解活性，可能引起腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡（immunognic cell death，ICD）［6-10］。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列是整合素最小的受體結(jié)合序列，是目前設(shè)計(jì)用來識(shí)別αvβ3的基序［11］。αvβ3 是影響腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、炎癥最突出的受體［12-14］，在上皮細(xì)胞和成熟內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)水平相對(duì)較低，但在腫瘤新生血管和一些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平較高，因此，RGD 序列具有介導(dǎo)腫瘤組織特異靶向的潛力［15］。HA 是流感病毒表面用于識(shí)別并吸附靶細(xì)胞的刺突蛋白［16］，本研究將具有靶向腫瘤組織的RGD-4C（CDCRGDCFC）構(gòu)建至流感病毒的HA 上，并檢測(cè)RGD 修飾對(duì)流感病毒溶瘤作用的影響。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及細(xì)胞 分別含PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和NS 的質(zhì)粒PHW200（八質(zhì)粒）由圣裘德兒童研究醫(yī)院病毒學(xué)和分子生物學(xué)系Robert G.Webster 教授惠贈(zèng)；經(jīng)RGD 修飾（HA-RGD）的八質(zhì)粒［PHW2000-HA 質(zhì)粒中HA 的信號(hào)肽（signal peptides，SP）序列后插入RGD 序列，并在兩端插入NedⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，為減小RGD 的空間位阻，在RGD 序列后添加了GSGG 柔性臂］由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子免疫實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，人腎上皮細(xì)胞（293T）、小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16-F10）、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）、宮頸癌細(xì)胞（TC-1）、小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞（CT26）、小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）和Vero 細(xì)胞由該實(shí)驗(yàn)室保存；MDCK 細(xì)胞由云南省疾病與控制中心保存。

1.2 主要試劑 RPMI1640 和DMEM-F12 培養(yǎng)基購(gòu)自以色列Biological Industrial 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和Opti-MEM 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；病毒RNA 抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾維贊生物科技股份有限公司；結(jié)晶紫購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；CCK8 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；甲型流感病毒（尿囊液）快速檢測(cè)試紙條購(gòu)自美國(guó)NBGene 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL／6 小鼠，雌性，6 ～ 8周齡，體重16 ～ 18 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所（IMBCAMS）小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF條件下飼養(yǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)為：SYXK 滇2019-0003。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)為：DWSP201905008）。9 ～ 10 日雞胚購(gòu)自云南普吉禽業(yè)有限公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10% FBS、100 U／mL 青霉素和0.1 mg／L 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)B16-F10、A549、TC-1、CT26、4T1 和Vero 細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為60%，用于后續(xù)試驗(yàn)；用含10%FBS、100 U／mL 青霉素和0.1 mg／L 鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)293T 和MDCK 細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為80%時(shí)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 流感病毒的拯救 將293T 細(xì)胞按5×105個(gè)／孔接種至6 孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜，細(xì)胞融合度達(dá)60% ～70%，更換為含10% FBS 的DMEM-F12 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。分別取八質(zhì)粒及RGD 修飾的八質(zhì)粒各500 ng，用Opti-MEM 補(bǔ)充至150 μL，室溫孵育5 min；將Lipofectamine 2000 與含八質(zhì)粒及含RGD 修飾的八質(zhì)粒的Opti-MEM 按1 ∶19 的體積比混勻，室溫孵育20 min［17］。將混合液滴加至6 孔板，300 μL／孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；補(bǔ)加1 mL 無(wú)抗培養(yǎng)基培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；將培養(yǎng)物凍融至少1次，于4 ℃，800 × g 離心5 min，收集上清液，用于病毒擴(kuò)增。八質(zhì)粒及RGD 修飾的八質(zhì)粒拯救的病毒分別為野生型流感病毒和重組RGD 流感病毒。

1.6 流感病毒的擴(kuò)增 于雞胚的雞頭正上方氣室邊緣約2 mm 處標(biāo)記，無(wú)菌條件下在標(biāo)記處打孔，經(jīng)小孔接種200 μL 拯救的病毒上清液［18］，石蠟封孔，置34 ℃，60%濕度的培養(yǎng)箱中孵育72 h，再置4 ℃過夜；無(wú)菌取尿囊液，經(jīng)10000 × g 離心20 min，收集上清。取300 μL，置1.5 mL EP 管中，用甲型流感病毒（尿囊液）快速檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，并參考文獻(xiàn)［19］，采用血凝試驗(yàn)檢測(cè)重組流感病毒及野生型流感病毒的血凝效價(jià)。

1.7 病毒傳代穩(wěn)定性的檢測(cè) 以距RGD 上游17 bp的一段序列及其下游160 bp 處的序列分別作為上下游引物，上游引物：5′-GGCAAAACTACTGGTCCTGTTATATGCAT-3′，下游引物：5′-CCAAGAGCCATCCGGTGATGTTACATT-3′，野生型及重組RGD 流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分別為233 和284 bp。引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成。將獲得的野生型和重組RGD 流感病毒均擴(kuò)增3 代（P2、P3、P4），用病毒RNA抽提試劑盒提取病毒RNA，以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃變性5 min，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.8 病毒大小的檢測(cè) 取野生型和重組RGD 流感病毒液，經(jīng)0.45 μm 濾器過濾，于4 ℃，40000 × g 離心2 h；用PBS 重懸，于顯微鏡下測(cè)量病毒大小。

1.9 病毒滴度的檢測(cè) 將MDCK 細(xì)胞按1×106個(gè)／孔接種至6 孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜；細(xì)胞融合度達(dá)80% ～90%時(shí)，無(wú)菌PBS 洗滌2 ～ 3 次；用含0.8% TPCK胰酶的無(wú)血清DMEM-F12 稀釋野生型及重組RGD 流感病毒，稀釋梯度為10-2～ 10-7，加入6 孔板，500 μL／孔，補(bǔ)加500 μL 含0.8%TPCK 胰酶的無(wú)血清DMEM-F12 培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；用PBS 洗滌2～3 次，將1.6%的瓊脂按1 ∶1 的比例加入含1.6%TPCK 胰酶的無(wú)血清DMEM-F12 培養(yǎng)基，混勻，加入6 孔板，2 ～ 3 mL／孔［20］，瓊脂糖凝固后繼續(xù)培養(yǎng)72 h；加入4%多聚甲醛，2 mL／孔，固定8 h；1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，鏡下觀察噬斑。選擇噬斑數(shù)在3～30 之間的孔，按下式計(jì)算病毒滴度。

1.10 流感病毒對(duì)不同細(xì)胞親嗜性的檢測(cè) 將B16-F10、A549、TC-1、CT26、4T1 和Vero 細(xì)胞按5 × 103個(gè)／ 孔接種至96 孔板，每種細(xì)胞設(shè)6 個(gè)重復(fù)，于37 ℃培養(yǎng)過夜；用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋病毒，使MOI 為0.1和0.01，加入96 孔板，100 μL／孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（僅加培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照（僅含細(xì)胞不加病毒），37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；去病毒液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，200 μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48 和72 h 時(shí)，加入CCK8 檢測(cè)液，10 μL／孔，避光孵育2 h；倒置熒光顯微鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞形態(tài)后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450和A620，并按下式計(jì)算細(xì)胞活力。

1.11 不同細(xì)胞中LDH 釋放率的檢測(cè) 將B16-F10、A549、TC-1、CT26、4T1 和Vero 細(xì)胞按1 × 104個(gè)／ 孔接種至48 孔板，處理方式同1.10 項(xiàng)，但每孔加入的培養(yǎng)基和病毒稀釋液的量提高1 倍，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔（僅有培養(yǎng)基）和細(xì)胞最大酶活性對(duì)照孔（含細(xì)胞不加病毒），培養(yǎng)71 h；細(xì)胞最大酶活性對(duì)照孔加入10% LDH 釋放劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h；取上清，500 × g 離心5 min，取120 μL 上清，加入96孔板，每個(gè)樣品設(shè)2 個(gè)復(fù)孔，用LDH 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)A490，并按下式計(jì)算LDH 釋放率。

1.12 流感病毒對(duì)小鼠體內(nèi)黑色素瘤腫瘤作用的檢測(cè)將B16-F10 細(xì)胞用PBS 調(diào)節(jié)至濃度為2×106個(gè)／mL，與等量基質(zhì)膠混勻。將小鼠經(jīng)腹部皮下接種混懸液，100 μL／只。接種后7 d，接種部位可觸摸到直徑約2 mm 的腫瘤，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3 組：野生型流感病毒組、重組RGD 流感病毒組、PBS 對(duì)照組。每隔1 d 經(jīng)瘤內(nèi)注射給藥1 次，100 μL／只，共注射5 次。于腫瘤細(xì)胞接種19 d 后，測(cè)量腫瘤大小；接種25 d 后，計(jì)算小鼠存活率。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本數(shù)據(jù)采用非配對(duì)／ 配對(duì)雙尾t 檢驗(yàn)或Two way ANOVA 檢驗(yàn)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒的鑒定 重組RGD 流感病毒經(jīng)膠體金法試紙條鑒定為陽(yáng)性，與野生型流感病毒一致，見圖1。表明病毒液中存在流感病毒。

圖1 野生型（A）及重組RGD 流感病毒（B）膠體金法試紙條鑒定Fig.1 Colloidal gold strip test of wild（A）and recombinant RGD influenza virus（B）

2.2 病毒效價(jià) 野生型及重組RGD 流感病毒的血凝效價(jià)分別為1 ∶28和1 ∶29，二者之間差異較小，見圖2。表明RGD 的插入并未影響流感病毒的效價(jià)。

圖2 血凝試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of HA test

2.3 流感病毒的傳代穩(wěn)定性 野生型和重組RGD流感病毒經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別于233 和284 bp 處可見目的條帶，見圖3。表明外源基因已成功插入，且傳代穩(wěn)定性良好。

圖3 PCR 法鑒定流感病毒的傳代穩(wěn)定性Fig.3 Identification of stability in subculture of influenza virus by PCR

2.4 病毒大小 野生型及重組RGD 流感病毒的直徑均在80 ～ 120 nm 范圍內(nèi)，見圖4。表明外源基因RGD 的引入并未改變病毒的大小。

圖4 鏡下觀察野生型（A）及重組RGD 流感病毒（B）的大小Fig.4 Microscopy of wild（A）and recombinant RGD influenza virus（B）

2.5 病毒滴度 野生型及重組RGD 流感病毒滴度分別為3×107和1.8×107PFU／mL，表明重組RGD流感病毒與野生型流感病毒在拯救過程中未發(fā)生改變。

2.6 流感病毒對(duì)不同細(xì)胞的親嗜性 B16-F10、A549、TC-1、CT26、4T1 及Vero 細(xì)胞陰性對(duì)照的細(xì)胞活力均為100%。野生型和重組RGD 流感病毒感染B16-F10和A549 細(xì)胞48 和72 h 后細(xì)胞活力大幅降低，其他細(xì)胞在感染病毒后細(xì)胞活力變化較小，見表1。B16-F10和A549 細(xì)胞在感染流感病毒后發(fā)生典型細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE），即細(xì)胞變圓、腫脹、脫落，其他細(xì)胞未見明顯CPE，見圖5。表明流感病毒對(duì)B16-F10和A549 細(xì)胞具有較好親嗜性，RGD 的引入并未改變流感病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的親嗜性。

圖5 野生型（A）及重組RGD 流感病毒（B）對(duì)各種細(xì)胞形態(tài)的影響（× 20000）Fig.5 Effect of wild（A）and recombinant RGD influenza virus（B）on morphologies of various cells（× 20000）

表1 流感病毒對(duì)各種細(xì)胞活力的影響（%）Tab.1 Effect of influenza virus on viabilities of various cells（%）

2.7 腫瘤細(xì)胞中LDH 的釋放率 MOI 為0.01 和0.1 時(shí)，與相應(yīng)野生型流感病毒組比較，重組RGD流感病毒組B16-F10 細(xì)胞中LDH 釋放率明顯升高（t 分別為44.18 和22.93，P 分別<0.001 和<0.05）；A549 細(xì)胞中LDH 釋放率略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為1.269 和0.323，P > 0.05）。其他細(xì)胞中LDH 釋放率均較低。見圖6。表明RGD 的引入使流感病毒對(duì)B16-F10 細(xì)胞的殺傷力增強(qiáng)。

圖6 各種細(xì)胞中LDH 的釋放率Fig.6 LDH release rates in various cells

2.8 流感病毒對(duì)小鼠體內(nèi)黑色素瘤腫瘤的作用 腫瘤細(xì)胞接種19 d 后，野生型流感病毒組及重組RGD流感病毒組小鼠腫瘤大小明顯小于PBS 組（t 分別為7.774 和5.437，P < 0.001），見圖7。腫瘤細(xì)胞接種25 d 后，PBS 組、野生型流感病毒組、重組RGD 流感病毒組小鼠存活率分別為50%、80%、80%，野生型流感病毒組和重組RGD 流感病毒組明顯高于PBS 組（t 均= 62.67，P < 0.05），見圖8。

圖7 各組小鼠體內(nèi)腫瘤的大小Fig.7 Size of tumors in mice of various groups

圖8 各組小鼠的存活率Fig.8 Survival rates of mice in various groups

3 討論

溶瘤流感病毒由于具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，病毒基因不會(huì)整合入宿主基因組及導(dǎo)致慢性疾病的特點(diǎn)，成為溶瘤病毒的優(yōu)良備選，但其對(duì)腫瘤組織的靶向性不足，較大程度限制了溶瘤效力。針對(duì)流感病毒靶向性，采用基因工程技術(shù)向流感病毒內(nèi)引入了靶向腫瘤組織新生血管和腫瘤組織的RGD 序列，以期增強(qiáng)流感病毒對(duì)于腫瘤組織的靶向性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型流感病毒比較，重組RGD 流感病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的親嗜性及對(duì)荷瘤小鼠的保護(hù)方面未發(fā)生改變。LDH 是細(xì)胞胞內(nèi)較為穩(wěn)定的酶，在細(xì)胞凋亡或壞死過程中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的LDH 釋放至培養(yǎng)液中。通過檢測(cè)從流感病毒感染后質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放至培養(yǎng)液中的LDH 釋放率來反映流感病毒對(duì)細(xì)胞的殺傷力。本研究表明，與相應(yīng)野生型流感病毒組比較，重組RGD 流感病毒組B16-F10 細(xì)胞中LDH 釋放率明顯升高（P < 0.05），A549 細(xì)胞中LDH 釋放率略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），其他細(xì)胞中LDH 釋放率均較低，表明RGD 的引入使流感病毒對(duì)B16-F10 細(xì)胞的殺傷力增強(qiáng)。

本研究對(duì)多種細(xì)胞親嗜性檢測(cè)結(jié)果顯示，重組RGD 流感病毒對(duì)B16-F10 細(xì)胞具有更好的吸附能力和更強(qiáng)的殺傷力，其原因可能是重組RGD 的流感病毒能更好地與高表達(dá)αvβ3 整合素黑色素瘤細(xì)胞吸附［21］，從而更高效地殺死腫瘤細(xì)胞。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇B16-F10 細(xì)胞經(jīng)皮下移植小鼠，建立了腫瘤模型，初步檢測(cè)溶瘤性流感病毒對(duì)腫瘤增殖的影響，結(jié)果表明，RGD 修飾的流感病毒在體內(nèi)并未呈現(xiàn)出更好的溶瘤效果，這與細(xì)胞水平的重組RGD 流感病毒較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷活力有差異，推測(cè)這與體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境與影響因素有關(guān)。另外，考慮到RGD 序列主要是通過識(shí)別腫瘤組織新生血管標(biāo)志物而促進(jìn)病毒的腫瘤靶向性，本研究體內(nèi)試驗(yàn)中采用的是瘤內(nèi)注射方式直接將病毒送入腫瘤組織，未充分體現(xiàn)其靶向的能力。

綜上所述，本研究拯救的重組RGD 流感病毒可作為進(jìn)一步基因工程修飾的基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒力及免疫調(diào)控基因修飾，為流感病毒溶瘤使用提供了新思路。在今后的研究中，將為重組RGD流感病毒增加熒光標(biāo)記或熒光基因表達(dá)，在體內(nèi)輸送時(shí)用于示蹤，驗(yàn)證RGD 對(duì)腫瘤組織的靶向性；其次重點(diǎn)調(diào)整給藥方式，采用系統(tǒng)給藥的方式驗(yàn)證其靶向能力。