王永琦，鄭 君，翁長江

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/基礎(chǔ)免疫創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由ASF 病毒（ASFV）引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，臨床上以高熱、食欲廢絕、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官廣泛性出血以及呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂為主要特征[1-3]，急性感染可導(dǎo)致家豬死亡率接近100%[4]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病[5]，我國在《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》中，將ASF 列為優(yōu)先防范的13 種重大動(dòng)物疫病之一。

2000 年病毒分類委員會(huì)第7 次報(bào)告中將ASFV 歸屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬[6]。ASFV 是目前發(fā)現(xiàn)唯一的蟲媒DNA 病毒，呈二十面體結(jié)構(gòu)，外有囊膜包被[7]。病毒基因組末端以共價(jià)鍵閉合，長度170 kb～190 kb，含有151個(gè)開放閱讀框（ORFs），編碼150～200 種蛋白質(zhì)[8]，其中50 多種為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。ASFV 基因組大致由3 部分組成：中部為長度約125 kb 的保守區(qū)、兩端分別為38 kb～48 kb 和13 kb～22 kb 的可變區(qū)及基因組末端約2.1 kb～2.5 kb 的反向重復(fù)序列[9]，兩端可變區(qū)的差異是不同病毒株的主要區(qū)別，該區(qū)包含5 個(gè)多基因家族（MGF）：MGF-360、MGF-300、MGF-110、MGF-100、MGF-505/530，pDP148R 蛋白屬于MGF-360 家族，這些基因家族均有發(fā)生變異的可能性，包括基因重組、缺失和突變等。

DP148R 是ASFV 復(fù)制過程中的早期表達(dá)蛋白，在病毒Benin 97/1 株中該蛋白由254 個(gè)氨基酸組成，而在病毒BA71V 株中其是由148 個(gè)氨基酸組成，在病毒HLJ/18 株中其是由237 個(gè)氨基酸組成，可見在不同的ASFV 株中表達(dá)的DP148R 蛋白大小有所區(qū)別。另外有報(bào)道表明，在病毒Benin 97/1 株中敲除該基因不會(huì)影響ASFV 在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，但可以大大降低病毒的毒力[10]；利用基因缺失的Benin-ΔDP148R 株免疫豬，能夠誘導(dǎo)其高水平的免疫保護(hù)，僅引發(fā)豬輕度的臨床癥狀，并可以抵抗親本病毒的攻擊，表明該蛋白在ASFV 感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要功能，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。為了進(jìn)一步研究DP148R 蛋白的生物學(xué)功能，本研究表達(dá)并純化了重組DP148R 蛋白，經(jīng)免疫小鼠、融合篩選，最終獲得了1株具有良好反應(yīng)性的DP148R蛋白單克隆抗 體（MAb），為鑒定DP148R 在ASFV 致病性中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 ASFV HLJ/18 株由本研究所分離并保存；HEK293T、骨髓瘤（SP2/0）細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）分離自30 日齡SPF豬；E. coliDH5a、E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa 公司；原核表達(dá)載體pET-28a、pGEX-6P-1 由本實(shí)驗(yàn)室保存；pCAGGS-Flag-DP148R 真核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室合成并保存；ASFV p72 蛋白多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；SPF 級(jí)6 周齡雌性BALB/c 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物均購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、XhoI 購自NEB 公司；同源重組試劑盒購自Vazyme 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購自QIAGEN 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司；Ni2+親和層析介質(zhì)購自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部；PEG 融合劑、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT 培養(yǎng)基添加劑、多聚甲醛、多聚賴氨酸、Triton X-100 和FLAGAgarose beads 購自Sigma 公司；TMB 顯色液購自天根生化科技（北京）有限公司；AlexaFlour?594 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 購自Invitrogen 公司；His 和FLAG 標(biāo)簽蛋白的MAb 購自Abmart 公司； DyLight?800 標(biāo)記的山羊抗鼠和抗兔IgG 購自LICOR 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、小鼠MAb Ig 亞類鑒定試劑盒購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；胰蛋白酶和PBS 由哈爾濱獸醫(yī)研究所診斷中心提供。

1.3DP148R基因的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank 中 登 錄 的ASFV HLJ/18 株DP148R基 因 序列，設(shè)計(jì)引物DP148R-F: 5'-CAGCAAATGGGTCGC GGATCCATGTTAGAAATAGTATTG-3'（下 劃 線 處 為BamH I 酶切位點(diǎn)）；DP148R-R: 5'-GTGGTGGTGGT GGTGGTGCTCGAGCTGGAGCAGCAGTAAGAAG-3'（下劃線處為XhoI 酶切位點(diǎn)）。以ASFV 基因組DNA 為模板，DP148R-F/DP148R-R 為引物，通過PCR 方法擴(kuò)增DP148R 基因。將PCR 產(chǎn)物克隆于經(jīng)EcoR I 和BamH I 雙酶切的pET-28a（+）載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-DP148R，并經(jīng)PCR 和測序鑒定后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組DP148R 蛋白的原核表達(dá)與純化 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-28a-DP148R 轉(zhuǎn)化到E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃220 r/min 培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，37 ℃220 r/min 誘導(dǎo)4 h。收集細(xì)菌并超聲破碎，離心后收集上清和沉淀，分別經(jīng)SDS-PAGE 鑒定重組蛋白的表達(dá)。利用Ni2+柱親和層析純化His-DP148R重組蛋白，測定蛋白濃度，以制備的鼠抗His 標(biāo)簽MAb 為一抗（1∶3 000），以DyLight?800 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 為二抗（1∶10 000），通過western blot 鑒定純化的重組蛋白并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組DP148R 蛋白MAb 的制備 以純化的重組DP148R 蛋白為免疫原，按常規(guī)方法免疫6 周齡雌性BALB/c 小鼠[11]，經(jīng)4 次免疫后無菌取出脾臟，分離脾細(xì)胞并制備懸液，將處于對數(shù)生長期的SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞以1∶1～1∶10 的比例置于50 mL 離心管中進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)間接ELISA 方法篩選穩(wěn)定分泌抗DP148R 蛋白MAb 的雜交瘤細(xì)胞株，并及時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)及凍存。將300 μL 弗氏不完全佐劑經(jīng)腹腔注射8 周齡BALB/c 小鼠，使其致敏，同時(shí)用篩選到的陽性雜交瘤細(xì)胞制備懸液，并按1×105個(gè)細(xì)胞/只注射于致敏的BALB/c 小鼠腹腔內(nèi)，5 d～7 d 后收集腹水，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MAb 效價(jià)的測定 利用小鼠MAb Ig 亞類鑒定試劑盒對已制備的MAb 進(jìn)行鑒定。將純化的重組DP148R 蛋白包被ELISA 板，含5%脫脂乳的PBST 于37 ℃封閉2 h。以制備的不同稀釋度的DP148R 蛋白MAb作為一抗（從1∶102～1∶106），以陰性小鼠血清作為對照，以羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）作為二抗，經(jīng)間接ELISA 方法檢測MAb 的效價(jià)。

1.7 MAb 識(shí)別的抗原表位的鑒定 將全長DP148R基因進(jìn)行部分重疊截短，截短的各個(gè)片段分別克隆至BamH I 和EcoR I 酶切的pGEX-6P-1 載體中，通過E. coliBL21(DE3)表達(dá)截短的重組蛋白。以截短的重組蛋白為抗原，以DP148R 蛋白MAb（1∶1 000）為一抗，DyLight?800 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測。將MAb 識(shí)別的片段再逐步截短表達(dá)，直到篩選到最小的抗原表位。

1.8 MAb 反應(yīng)原性的western blot 鑒定 分別將0.5 μg、1 μg、2 μg 真 核 表 達(dá) 質(zhì) 粒pCAGGS-Flag-DP148R 轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞中，24 h 后收集細(xì)胞；同時(shí)利用ASFV HLJ/18 株感染PAMs 細(xì)胞，分別在12 h、24 h、36 h 和48 h 收 集 細(xì) 胞。用 含1% NP40 Lysis buffer 裂解細(xì)胞并收集上清，以鼠DP148R 蛋白MAb（1∶500）作為一抗，DyLight?800 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶10 000）作 為 二 抗，經(jīng)western blot 檢 測HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)的Flag-DP148R 蛋白及ASFV 感染的PAMs 細(xì)胞中表達(dá)的DP148R 蛋白，分析MAb 的反應(yīng)原性。

1.9 MAb 反應(yīng)原性的間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定 將pCAGGS-Flag-DP148R 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，24 h 后固定細(xì)胞，0.3% Triton X-100 室溫透膜15 min，10% FBS 室溫封閉2 h，以鼠DP148R蛋白MAb（1∶50）作為一抗，Alexa Flour?594 標(biāo)記的羊 抗 鼠IgG（1∶2 000）作 為 二 抗， 經(jīng)IFA 檢 測HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)的Flag-DP148R 蛋白與ASFV 感染的PAMs 細(xì)胞中表達(dá)的DP148R 蛋白，進(jìn)一步分析MAb 的反應(yīng)原性。

2 結(jié) 果

2.1 ASFV 重組DP148R 蛋白的表達(dá)與純化 將經(jīng)PCR 及測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-28a-DP148R轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3）并誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，在27 ku 處有一條目的條帶，且蛋白主要在重組菌裂解液的沉淀中，與預(yù)期一致（圖1A）。通過親和層析純化目的蛋白并利用His 抗體經(jīng)western blot鑒定，結(jié)果顯示在27 ku 處有一條特異性條帶，且無雜帶（圖1B）。表明重組DP148R 蛋白獲得了表達(dá)，且對該蛋白的純化效果較好。

圖1 ASFV重組DP148R蛋白表達(dá)的SDS-PAGE（A）及其純化的western blot（B）鑒定結(jié)果Fig.1 The SDS-PAGE(A)of the ASFV recombinant DP148R protein expressed in E.coli and the western blot(B)of the purified protein

2.2 MAb 效價(jià)的測定 將ASFV 重組DP148R 蛋白免疫小鼠后的脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞融合，經(jīng)3 次克隆純化，最終獲得1 株穩(wěn)定分泌DP148R 蛋白MAb 的雜交瘤細(xì)胞株。利用這株細(xì)胞注射BALB/c 小鼠腹腔，將獲得的MAb 命名為7D6。利用抗體亞類鑒定試劑盒鑒定該MAb 為IgG2b 亞型。利用間接ELISA 方法測定7D6的效價(jià)，當(dāng)7D6以1∶105稀釋時(shí)，其與陰性血清OD450nm值之比（P/N）≥2.1，因此7D6的效價(jià)為1∶105。

2.3 7D6 識(shí)別的抗原表位鑒定 將全長DP148R 重組蛋白第一次截為8 段，并分別作為抗原進(jìn)行west?ern blot鑒定，結(jié)果顯示aa1～aa50肽段能夠被7D6識(shí)別（圖2A）；將重疊部分第二次截為8 段，結(jié)果顯示aa21～aa40 肽段能夠被7D6 識(shí)別（圖2B）；將重疊部分第三次截為11 段，結(jié)果顯示aa29～aa38 能夠被7D6識(shí)別，且MAb 7D6 與其余片段均不反應(yīng)（圖2C），表明DP148R MAb 識(shí)別的抗原表位位于DP148R 蛋白的aa29～aa38，序列為“LYWVFRAIHI”。

圖2 Western blot鑒定7D6識(shí)別的抗原表位Fig.2 Identification of antigenic epitopes recognized by 7D6 by western blot

2.4 MAb 反應(yīng)原性的western blot 鑒定結(jié)果 將不同濃度的pCAGGS-Flag-DP148R 真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞中，24 h 后收集細(xì)胞；同時(shí)利用ASFV HLJ/18 株感染PAMs 細(xì)胞不同時(shí)間，收集細(xì)胞沉淀。上述細(xì)胞裂解后均經(jīng)western blot 鑒定。結(jié)果顯示，7D6 可以識(shí)別HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)的Flag-DP148R 蛋白，該蛋白也可以被Flag 標(biāo)簽抗體識(shí)別，其大小與預(yù)期結(jié)果一致，且隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的增加，抗體能夠識(shí)別的蛋白水平也逐漸增加（圖3A）；7D6 也可以識(shí)別PAMs 細(xì)胞中表達(dá)的DP148R 蛋白，且隨著ASFV HLJ/18 株感染時(shí)間的延長，MAb 識(shí)別的DP148R 蛋白水平也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。P72 蛋白為ASFV 編碼的衣殼蛋白，利用P72 的抗體檢測是為了證明病毒在細(xì)胞中獲得了復(fù)制且隨著感染時(shí)間的增加其復(fù)制水平增加（圖3B）。結(jié)果表明DP148R MAb能夠在western blot 檢測中特異性識(shí)別在HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)的DP148R 蛋白和ASFV 感染的PAMs 細(xì)胞中表達(dá)的DP148R 蛋白，反應(yīng)原性較強(qiáng)。

圖3 Western blot鑒定MAb的反應(yīng)原性Fig.3 The reactivity of MAb was identified by western blot

2.5 DP148R 蛋白MAb 反應(yīng)性的IFA 鑒定結(jié)果 將pCAGGS-Flag-DP148R 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞；同時(shí)用ASFV感染PAMs細(xì)胞，然后用多聚甲醛固定細(xì)胞進(jìn)行IFA 檢測。結(jié)果顯示，制備的MAb 7D6與Flag 標(biāo)簽抗體均檢測到了HEK293T 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Flag-DP148R 蛋白，呈現(xiàn)紅色熒光（圖4A），同樣7D6也能夠檢測到ASFV 感染PAMs 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的DP148R蛋白，呈現(xiàn)紅色熒光，P72抗體的作用與2.4中描述的一樣（圖4B）。表明純化的DP148R蛋白MAb能夠用于IFA 檢測HEK293T細(xì)胞中表達(dá)的DP148R蛋白和ASFV感染的PAMs細(xì)胞中表達(dá)的DP148R蛋白，進(jìn)一步表明制備的MAb的反應(yīng)原性較強(qiáng)。

圖4 IFA鑒定MAb 7D6的反應(yīng)原性Fig.4 The reactivity of MAb 7D6 was identified by IFA

3 討 論

作為中國一類動(dòng)物傳染病的ASF，自2018 年8月在遼寧省沈陽市首次報(bào)道后，疫情迅速蔓延至全國各地[12]，其強(qiáng)毒株感染的發(fā)病率和致死率可高達(dá)100%，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的打擊。目前疫情的防控手段主要包括流行病學(xué)檢測、劃定疫區(qū)、撲殺和凈化等[13-14]，依靠生物安全和撲殺措施控制ASF 難度很大，迫切需要研發(fā)有效疫苗?；蛉笔p毒活疫苗是有潛力和希望的一種ASF 疫苗研發(fā)策略，有報(bào)道顯示，通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建的一株7個(gè)基因缺失的重組ASFV（HLJ/18-7GD）能對ASF 強(qiáng)毒的致死性攻擊提供有效的抵抗能力[15]。DP148R基因是參與ASFV 感染宿主過程的重要毒力相關(guān)基因，在病毒感染細(xì)胞后的早期表達(dá)。在ASFV Benin 97/1 株中敲除DP148R基因不會(huì)降低病毒在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制水平，但是可以大大降低病毒的毒力。利用BeninΔDP148R 病毒通過肌肉注射和鼻腔途徑免疫豬后，可以抵抗親代ASFV 強(qiáng)毒的攻擊，肌肉途徑免疫組的豬全部存活，鼻腔途徑免疫組除了一只豬死亡外全部存活[10]，說明DP148R基因也有望成為ASF 疫苗研制中的有效靶點(diǎn)，但目前對于DP148R基因的功能研究尚不完善，DP148R 蛋白具體的生物學(xué)功能仍待闡明。

本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化了重組DP148R 蛋白。相對于真核細(xì)胞表達(dá)而言，原核表達(dá)能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)效率高，而且所需的成本相對比較低廉。郝麗影等采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ASFV 重組p30 蛋白，制備并鑒定了p30 蛋白的MAb，腹水抗體效價(jià)達(dá)1∶40 000，且具有良好的特異性和反應(yīng)性[16]；向志達(dá)等利用原核表達(dá)載體構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21a-A137R，成功表達(dá)ASFV pA137R 蛋白，由此制備的兔源多克隆抗體能特異性識(shí)別瞬時(shí)表達(dá)的Flag-A137R 蛋白和ASFV 感染PAM 細(xì)胞中表達(dá)的ASFV A137R 蛋白，說明采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白并制備MAb 是可行且應(yīng)用廣泛的[17]。雖然重組DP148R蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，但通過western blot 和IFA鑒定，證明該MAb 可以識(shí)別并結(jié)合HEK293T細(xì)胞中表達(dá)的Flag-DP148R蛋白和ASFV感染PAMs細(xì)胞中的內(nèi)源性DP148R 蛋白，說明制備的MAb 具有良好的反應(yīng)原性。由于使用His-DP148R 蛋白作為免疫原，所以在進(jìn)行間接ELISA 篩選試驗(yàn)時(shí)，先采用His-DP148R 蛋白作為包被抗原初步篩選陽性克隆，再用專門的His 標(biāo)簽抗原包被酶標(biāo)板，細(xì)胞上清作為一抗進(jìn)行間接ELISA 檢測，挑選出重組His-DP148R蛋白OD450nm值陽性，且His 標(biāo)簽蛋白OD450nm值為陰性的細(xì)胞孔繼續(xù)試驗(yàn)，排除了針對His 標(biāo)簽的克隆，保證篩選到針對DP148R 蛋白的特異性MAb 細(xì)胞株。

本研究制備了特異性識(shí)別ASFV DP148R 蛋白的鼠源MAb 7D6，該MAb 的效價(jià)較高，反應(yīng)原性良好，為進(jìn)一步鑒定DP148R 蛋白的生物學(xué)功能及其在ASFV 感染和致病性中的作用提供了良好的材料。