張佳琦，王亞玉，郭 興，林躍智*，廖化新，王曉鈞*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/馬傳染病和慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，廣東 廣州 510632）

馬傳染性貧血?。‥quine infectious anemia，EIA）是一類嚴(yán)重危害馬屬動(dòng)物的傳染病。該病病原EIA病毒（EIAV）與人免疫缺陷病毒（HIV-1）同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬[1]。經(jīng)過體內(nèi)、體外的長期傳代，我國成功獲得了可以提供免疫保護(hù)的弱毒疫苗株，有效地控制了EIA 在我國的流行[2]。因此，對(duì)EIAV的研究不僅可以促進(jìn)對(duì)慢病毒病原學(xué)的認(rèn)知，更可為慢病毒保護(hù)性免疫機(jī)制的研究提供重要模型[3]。

病毒侵入宿主細(xì)胞的過程始于病毒囊膜蛋白（Env）與宿主受體間的結(jié)合。EIAV 的Env 是由表面蛋白（Gp90）和跨膜蛋白（Gp45）組成，既是病毒粘附、細(xì)胞間融合、傳播過程中的關(guān)鍵蛋白，也是重要的免疫原，存在于多個(gè)中和抗體表位、Th 表位和CTL 表位[4]，是針對(duì)EIAV 產(chǎn)生中和抗體的主要靶蛋白。多項(xiàng)研究表明，Env 變異非?；钴S，即便是感染馬在無癥狀階段（即機(jī)體免疫成熟階段），其變異仍在持續(xù)發(fā)生[3]，這影響了宿主免疫系統(tǒng)對(duì)Env 抗原的識(shí)別。另外，Env 蛋白因基因變異導(dǎo)致其糖基化位點(diǎn)的改變也會(huì)影響病毒表面的構(gòu)象，影響中和抗體與病毒的結(jié)合，從而導(dǎo)致病毒的免疫逃逸，因此Env的高變異性與病毒的免疫逃逸密切相關(guān)[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)Env 變異與EIAV 毒力息息相關(guān)，且Env 多樣性的特征是EIAV 弱毒疫苗產(chǎn)生保護(hù)性免疫的關(guān)鍵因素[5]。因此，深入探究Env 對(duì)EIAV 致病性及免疫保護(hù)中的作用對(duì)抗慢病毒研究具有重要意義，但缺乏Env 單克隆抗體（MAb）一直限制該方面的研究。

單個(gè)B 淋巴細(xì)胞的抗體基因擴(kuò)增技術(shù)是利用記憶性B 淋巴細(xì)胞表面表達(dá)B 細(xì)胞受體（BCR）的特點(diǎn)，采用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)從樣本（外周血/脾臟）中分選出靶蛋白的單個(gè)記憶性B 淋巴細(xì)胞。隨后通過RT-PCR 和套式PCR，獲得特異性識(shí)別靶蛋白的MAb 的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列（Ig VH 和Ig VL）。通過重疊延伸PCR 分別構(gòu)建表達(dá)抗體Ig VH 和Ig VL的真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染后獲得多個(gè)重組的MAb[6]。與傳統(tǒng)的MAb 制備技術(shù)相比，該方法具有以下優(yōu)勢：1）通過單個(gè)細(xì)胞RT-PCR 所獲得的抗體重鏈、輕鏈均來自于同一個(gè)漿細(xì)胞，保持了抗體天然組合，其三維空間結(jié)構(gòu)與自然感染后產(chǎn)生的特異性抗體的空間結(jié)構(gòu)更為相似，可減少抗體重組表達(dá)后活性的丟失；2）制備方法方便、高效。從分離單個(gè)細(xì)胞到得到抗體僅需不到1 個(gè)月的時(shí)間，大大縮減了MAb 制備時(shí)間；3）當(dāng)免疫原不能有效誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生或抗體效價(jià)低時(shí)，該方法仍可分離到有效的抗體；4）由于其龐大的抗體基因候選庫，通過該項(xiàng)技術(shù)獲得保護(hù)性中和抗體甚至廣譜性中和抗體都成為了可能，這是該方法區(qū)別于傳統(tǒng)的雜交瘤融合技術(shù)制備MAb 的最大優(yōu)勢[7]。目前該方法已廣泛用于HIV-1、破傷風(fēng)、乙型肝炎、流感等多種疾病病原抗體庫的建立，并且也研發(fā)出基于人源、鼠源、豬源和牛源等多個(gè)物種的高通量抗體篩選平臺(tái)[8-9]。本研究利用MAb 基因擴(kuò)增技術(shù)，獲得了特異性良好的Gp90 MAb，可為后續(xù)Env 的功能學(xué)研究及闡明EIAV 的致病及免疫保護(hù)機(jī)制提供重要工具。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人胚胎腎細(xì)胞HEK293T、HEK293F 以及表達(dá)載體pcDNA3.1 由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；6 周齡～8 周齡SPF 級(jí)BALB/c小鼠（體質(zhì)量為15 g～20 g）購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Sigma 公司；胎牛血清購自Wisent 公司；DNA 轉(zhuǎn)染試劑PolyJet 購自Signagen Laboratories 公司、PEI 購自Polysciences 公司；KOD 高保真酶購自Toyobo 公司；Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen 公司；HotStarTaqPlus 酶購自QIAGEN 公司；Lgepal 酶購自Sigma 公司；重組核糖核酸酶抑制劑RNase OutTM購自G-Biosciences 公司；2×TaqPCR Mixture 購自北京博奧龍免疫技術(shù)公司；PE 熒光染料標(biāo)記試劑盒購自Biotium 公司；BV421 熒光染料及anti-mouse CD4-FITC、anti-mouse CD8a-FITC、anti-mouse B220-APC、anti-mouse IgD-PE 等熒光標(biāo)記抗體均購自BD biosciences 公司；His MAb、β-actin MAb 購自Abcam 公司；紅外熒光標(biāo)記羊抗兔IgG（IgG-Dylight 700）、紅外熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG（IgG-Dylight 800）購自KPL 公司；LIVE/DEAD Fix?able Aqua Dead Cell Stain Kit 購 自Thermo Fisher 公 司；Protein A Matrix Antibody 純化試劑盒、His-tag 蛋白純化試劑盒購自Beaver 公司；RNA 提取試劑盒購自BioFlux 公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白預(yù)制膠、變性蛋白電泳緩沖液和非變性蛋白電泳緩沖液購自金斯瑞公司；所有引物和測序均由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

1.3 Gp90 真核表達(dá)質(zhì)粒的制備及表達(dá) 根據(jù)Gen?Bank 登錄的EIAV 參考株（AF509240.1）的Env 基因序列，截取其中Gp90 胞外區(qū)基因片段，依據(jù)哺乳動(dòng)物密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化合成（金斯瑞）。在上游引物（P1）引入信號(hào)肽GAGACCGACACCCTGCTGCTGT GGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGCG AC。下游引物（P2）引入10×His 標(biāo)簽序列CACCACCA CCACCACCACCACCACCACCAC。P3/P4 用于擴(kuò)增載體序列并引入與插入片段互補(bǔ)的同源臂（表1）。利用Seam?less Assembly Cloning Kit 將擴(kuò)增產(chǎn)物和載體片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)后獲得重組質(zhì)粒。經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-sgp90-His。隨后，利用PolyJet 轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞48 h 后收集細(xì)胞和上清，分別以兔源抗His MAb 和鼠源抗β-actin MAb 為一抗（1∶10 000），以Dylight 700 標(biāo)記羊抗兔IgG 和Dylight 800 標(biāo)記羊抗鼠IgG 為二抗（1∶5 000），采用western blot 檢測Gp90 蛋白的表達(dá)情況。鑒定正確的重組質(zhì)粒用于后續(xù)動(dòng)物免疫。實(shí)驗(yàn)設(shè)空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陰性對(duì)照。

表1 目的基因擴(kuò)增所用的引物序列Table 1 Primers used for PCR amplification

1.4 Gp90 蛋白的制備 利用PolyJet 轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-s-gp90-His 轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，用PBS 重懸并超聲裂解后取上清液，利用His-tag 蛋白純化試劑盒純化Gp90 蛋白。純化的Gp90 蛋白分別用于FACS 分選單個(gè)B 細(xì)胞的染色標(biāo)記及Gp90 MAb 的ELISA 鑒定。

1.5 小鼠免疫實(shí)驗(yàn) 采用重組質(zhì)粒pcDNA3.1-sgp90-His 多次免疫雌性BALB/c 小鼠，免疫小鼠數(shù)量為3 只，每只小鼠分別在第0、2、4、6、8、10 周免疫（共計(jì)6 次），接種部位為股四頭肌，免疫劑量為100 μg/只。小鼠在免疫前以及第2～6 次免疫后3 d 采集尾靜脈血，分離血清備用。第6 次免疫后，以小鼠血清（1∶200，1∶400，…，1∶204 8000）為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶5 000）為二抗，采用ELISA檢測免疫小鼠血清抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1∶25 600 時(shí)迫殺小鼠，無菌采集免疫小鼠的脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)凍存。

1.6 熒光激活細(xì)胞分選（FACS）小鼠脾單個(gè)B細(xì)胞 將分離的小鼠脾細(xì)胞用RPMI 1640 培養(yǎng)基（10%FBS）清洗3次。將anti-mouse CD4-FITC（50 μL/sample）、anti-mouse CD8a-FITC（50 μL/sample）、anti-mouse B220-APC（50 μL/sample）、anti-mouse IgD-PE（50 μL/sample）、細(xì)胞活性染料Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit（50 μL/sample）分別與用PE 和BV421 按照PE 染料標(biāo)記試劑盒標(biāo)記的Gp90 蛋白混勻后加入到脾細(xì)胞懸液中，避光染色30 min，PBS（2% FBS）洗滌2 次，用3 mL PBS（5% FBS）重懸細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀依據(jù)不同的表面標(biāo)記物進(jìn)行分選。逐步篩選并去除死細(xì)胞、根據(jù)Live/CD4-/CD8a-/B220+獲得B220+陽性表型的B 淋巴細(xì)胞、依據(jù)記憶性B 細(xì)胞的表面標(biāo)記特征:CD4-/CD8-/B220+/IgD-/特異性抗原+[10]，選取IgD-的B 淋巴細(xì)胞Live/CD4-/CD8a-/B220+/IgD-并最終通過熒光標(biāo)記（PE 和BV421）的Gp90 蛋白篩選出特異性識(shí)別Gp90 蛋白的B 淋巴細(xì)胞，其表型為Live/CD4-/CD8a-/B220+/IgD-/Gp90+，將細(xì)胞稀釋至500 個(gè)/mL，以每孔0.5 μL（約1 個(gè)細(xì)胞）的劑量加入96 孔PCR 板中，用于后續(xù)PCR 擴(kuò)增。

1.7 套 式PCR 擴(kuò) 增Gp90 MAb Ig VH 和Ig VL 基因 分別提取1.6 中獲得多個(gè)單一B 細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄分別獲得單個(gè)細(xì)胞的cDNA，以其為模板采用套 式PCR 擴(kuò) 增Gp90 MAb 的Ig VH 和Ig VL 基 因。第一輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系10 μL：cDNA 1 μL，HotStar?TaqPlus酶1 U，dNTPs 0.2 mmol/L，Ig VH 或Ig VL 上下游引物各0.5 μL，ddH2O 調(diào)整總體積為10 μL。PCR反 應(yīng) 條 件 為：95 ℃5 min；95 ℃30 s、55 ℃60 s、72 ℃90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。第二輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系50 μL：第一輪PCR 反應(yīng)產(chǎn)物3 μL，Hot?StarTaqPlus 酶5 U，dNTPs 0.2 mmol/L，Ig VH 或Ig VL上下游引物各0.5 μL，ddH2O調(diào)整總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃30 s、58 ℃60 s、72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。PCR 終產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產(chǎn)物采用Qiagen PCR purifi?cation kit 純化后測序鑒定。（該步驟中涉及的所有引物目前均在專利申請(qǐng)過程中，故未表述）。

1.8 Gp90 MAb Ig VH 和Ig VL 線性表達(dá)載體的構(gòu)建 利用重疊延伸PCR 將擴(kuò)增的Gp90 MAb Ig VH 和Ig VL 鏈分別與抗體恒定區(qū)表達(dá)載體（包含CMV 啟動(dòng)子、人恒定區(qū)及多聚A 尾，專利申請(qǐng)中）融合成全長重鏈和輕鏈基因。反應(yīng)體系50 μL：模板1.5 μL，VH 鏈或VL（κ 鏈）的正向引物、反向引物（申請(qǐng)專利中）各1 μL，dNTPs 1 μL，Q5 reaction buffer 10 μL，high fidelity DNA polymerase（Biolabs）0.5 μL，ddH2O 33 μL。PCR 擴(kuò) 增 條 件：95 ℃5 min；95 ℃30 s、58 ℃60 s、72 ℃90 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。隨后將全長MAb 重鏈和輕鏈基因分別克隆至pcDNA3.1中，經(jīng)測序鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pcDNA3.1-VH 和pcDNA3.1-VL。

1.9 Gp90 MAb的篩選與純化 待HEK293T細(xì)胞長至80%～90%密度時(shí)，利用PolyJet轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1-VH和pcDNA3.1-VL重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞（各1 μg）6 h 后，換5%細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞上清。以純化的Gp90 蛋白（200 ng/孔）為包被抗原，各Gp90 MAb 細(xì)胞上清以1∶200 為初始稀釋度按照2 倍倍比稀釋（21倍～212倍）后分別為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶5 000）作為二抗，采用ELISA 方法進(jìn)行檢測。試驗(yàn)以小鼠終末免疫后的血清為陽性對(duì)照。

將ELISA 結(jié) 果 呈 陽 性 的pcDNA3.1-VH 和pcD?NA3.1-VL 重組質(zhì)粒按照1∶1 的比例（各500 μg）參照PEI 轉(zhuǎn)染方法共轉(zhuǎn)染至密度為2×106個(gè)/mL 總體積為500 mL 的HEK293F 懸浮細(xì)胞中，5 d 后收集細(xì)胞上清，按照Protein A 純化方法純化Gp90 MAb。純化的Gp90 MAb 經(jīng)檢測并用于后續(xù)western blot 的鑒定。

1.10 Gp90 MAb 的western blot 鑒定 將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-s-gp90-His 參 照PolyJet 轉(zhuǎn) 染 方 法 轉(zhuǎn) 染 至HEK293T 中，48 h 后收集細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[11]將細(xì)胞分別進(jìn)行變性及非變性的處理，制備成相應(yīng)的蛋白樣品后進(jìn)行變性凝膠電泳（SDS-PAGE）和非變性凝膠電泳（native SDS-PAGE），隨后將蛋白印跡電轉(zhuǎn)至NC膜上，以純化的Gp90 MAb（1∶500）或者鼠源抗His MAb（1∶10 000）作為一抗，紅外線標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶10 000）進(jìn)行Gp90 MAb的western blot檢測。

另外，將EIAV 感染馬巨噬細(xì)胞36 h 后收集細(xì)胞，通過上述western blot 方法驗(yàn)證本研究制備的Gp90 MAb 對(duì)EIAV 感染靶細(xì)胞狀態(tài)下Gp90 蛋白的識(shí)別情況。

2 結(jié) 果

2.1 Gp90 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其重組蛋白表達(dá) 以優(yōu)化過的Gp90基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增獲得約1 450 bp的片段，大小與預(yù)期相符（圖1A），將獲得的目的片段以及分泌型信號(hào)肽連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1 中構(gòu)建Gp90 真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確的質(zhì)粒命名 為pcDNA3.1-s-gp90-His。將pcDNA3.1-s-gp90-His 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞，裂解細(xì)胞進(jìn)行west?ern blot 鑒定，結(jié)果顯示：細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解物中均可見目的蛋白的表達(dá)，但以上清表達(dá)居多（≈90 ku）（圖1B），表明重組Gp90 蛋白能夠以分泌形式獲得正確表達(dá)。

圖1 Gp90基因片段的PCR擴(kuò)增及表達(dá)鑒定Fig.1 PCR amplification of gp90 gene fragment and expression identification

2.2 小鼠脾單個(gè)B 淋巴細(xì)胞的分離 本實(shí)驗(yàn)共分選了2 只免疫小鼠的脾細(xì)胞，共計(jì)2×108個(gè)脾細(xì)胞，按照步驟1.6，利用流式細(xì)胞儀先后通過圈定DEAD-細(xì)胞群去除死細(xì)胞（DEAD+表型為死細(xì)胞）（圖2A）后，經(jīng)CD4+CD8+和B220+（圖2B、圖2C）標(biāo)記物篩選，選取IgD-的B 淋巴細(xì)胞Live/CD4-/CD8a-/B220+/IgD-（圖2D）、通過熒光標(biāo)記（PE 和BV421）的Gp90 蛋白等標(biāo)記物選取特異性識(shí)別Gp90 蛋白的B 淋巴細(xì)胞（圖2E），結(jié)果顯示共得到890個(gè)Gp90+B淋巴細(xì)胞，可用于后續(xù)PCR試驗(yàn)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分選可特異性識(shí)別Gp90的小鼠記憶B淋巴細(xì)胞Fig.2 Flow cytometry sorting memory B lymphocytes that specifically recognize Gp90

2.3 Gp90 MAb 的Ig VH 和Ig VL 基因的套式PCR擴(kuò)增結(jié)果 以分選的890 個(gè)Gp90 特異性記憶B 淋巴細(xì)胞基因組分別為模板，采用抗體可變區(qū)特異性引物對(duì)抗體的Ig VH 和Ig VL 分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增片段測序并比對(duì)，結(jié)果顯示，共獲得27 對(duì)互相匹配的Gp90 MAb Ig VH和Ig VL基因（圖3）。

圖3 抗體可變區(qū)重鏈（A）/輕鏈（B）的套式PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of heavy(A)/light(B)chain variable region

2.4 重組Gp90 MAb的篩選純化結(jié)果 將2.3中27對(duì)互相匹配的Gp90 MAb Ig VH 和Ig VL 基因?qū)?yīng)的pcD?NA3.1-VH 和pcDNA3.1-VL 重 組 質(zhì) 粒 分 別 共 轉(zhuǎn) 染HEK293F，5 d后收集細(xì)胞上清，通過ELISA檢測所獲得MAb的反應(yīng)性。結(jié)果顯示：在27組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清中，有4組樣品的OD450nm值高于陰性對(duì)照組，表明這4株MAb和Gp90蛋白具有良好的反應(yīng)性（圖4A）（僅展示陽性結(jié)果）。隨后將4株鑒定后的Gp90 MAb大批量表達(dá)及純化并經(jīng)SDS-PAGE檢測（圖4B），結(jié)果顯示重鏈約50 ku，輕鏈約25 ku，分別為G2、G4、G5、G6。

圖4 ELISA檢測Gp90 MAb的反應(yīng)性（A）及純化結(jié)果（B）Fig. 4 Detection of recombinant monoclonal antibody reactivity of Gp90 by ELISA(A)and antibody purification results(B)

2.5 Gp90 MAb 的western blot 鑒定 為了進(jìn)一步鑒定篩選的4 組Gp90 MAb（G2/G4/G5/G6）與Gp90 蛋白的反應(yīng)性，采用western blot 檢測其對(duì)過表達(dá)的Gp90 蛋白以及模擬感染模式下的天然Gp90 蛋白的識(shí)別情況。結(jié)果顯示：所獲得的4 株Gp90 MAb 僅在非變性的條件下，可識(shí)別出目的蛋白條帶，而在變性的條件下未能檢測到目的蛋白，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)利用His 抗體排除了過表達(dá)Gp90 質(zhì)粒未表達(dá)的干擾（圖5）。表明這4 株Gp90 MAb 可以識(shí)別Gp90 的天然構(gòu)象表位，而不能識(shí)別Gp90 線性表位（此處僅展示結(jié)果最顯著的Gp90 G2 號(hào)MAb 的western blot 結(jié)果）。

圖5 Gp90單克隆抗體的western blot分析Fig.5 Western blot analysis of Gp90 recombinant antibody

3 討 論

EIA 嚴(yán)重影響和危害我國馬匹動(dòng)物健康，對(duì)其病原EIAV 的研究不僅可以促進(jìn)對(duì)慢病毒病原學(xué)的認(rèn)知，還可為慢病毒保護(hù)性免疫機(jī)制的研究提供重要模型。EIAV Env 蛋白是病毒傳播及致病過程中的關(guān)鍵蛋白，但受限于相關(guān)抗體的缺失，對(duì)該蛋白的研究一直未能取得深層次的進(jìn)展。因此，本研究首次采用FACS 技術(shù)以及抗體基因擴(kuò)增技術(shù)的組合策略制備EIAV Gp90 的MAb，為Env 蛋白的進(jìn)一步研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究根據(jù)B 細(xì)胞表面的特征分子，利用FACS技術(shù)從免疫小鼠的脾臟（B 細(xì)胞庫）中分離到單個(gè)的可分泌抗體且具有特異性識(shí)別Gp90 蛋白功能的B 細(xì)胞890 個(gè)。雖然小鼠免疫后的抗體效價(jià)不高，但仍然從2×108個(gè)脾細(xì)胞中分選獲得了890 個(gè)Gp90+B 淋巴細(xì)胞，說明本研究選擇的表面分子標(biāo)記物可行，但進(jìn)一步從890 個(gè)Gp90+B 淋巴細(xì)胞中篩選時(shí)僅獲得了27 對(duì)抗體基因?qū)?，可見本?shí)驗(yàn)篩選效率并不高，根據(jù)相關(guān)研究分析，推測這可能是由于細(xì)胞表面分子標(biāo)記物在本研究中應(yīng)用可行，但并非最優(yōu)，后續(xù)可以通過增加CD19+/CD27+/CD38+或者IgM-等表型特征進(jìn)一步優(yōu)化[12-13]?？贵w親和力成熟及抗體亞型轉(zhuǎn)變的深入研究對(duì)于細(xì)胞表面分子標(biāo)記物的選擇與優(yōu)化至關(guān)重要，也將為本研究通過單個(gè)B 淋巴細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)篩選MAb 奠定理論基礎(chǔ)。

本研究獲得了27 對(duì)匹配的Gp90 MAb Ig VH 和Ig VL 基因，該方法高效省時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)獲得了EIAV 囊膜蛋白Gp90 的MAb。Gp90 蛋白作為EIAV 的囊膜蛋白，其在病毒感染周期中的主要功能是與受體特異性識(shí)別，引起跨膜區(qū)構(gòu)象改變，從而介導(dǎo)病毒侵入靶細(xì)胞[14]。因此，能否與天然構(gòu)象的Gp90 蛋白結(jié)合是鑒定Gp90 MAb 生物學(xué)活性的重要指標(biāo)。本研究通過ELISA、western blot 鑒定，最終得到了4 株可有效識(shí)別天然構(gòu)象Gp90 蛋白的重組Gp90 MAb，證實(shí)本研究表達(dá)的Gp90 MAb可以用于后續(xù)EIAV致病機(jī)制及EIAV 弱毒疫苗作用機(jī)制等研究中。由于該方法可提供龐大的抗體候選基因庫，本研究團(tuán)隊(duì)后續(xù)將進(jìn)一步評(píng)價(jià)目前所獲得的4 株Gp90 MAb 的識(shí)別表位以及抗體在動(dòng)物體內(nèi)的保護(hù)性作用，繼續(xù)篩選具有廣泛性中和作用的Gp90 MAb。

另外，本研究在重組質(zhì)粒免疫小鼠后，分離脾細(xì)胞時(shí)平行進(jìn)行了雜交瘤細(xì)胞的多次融合，均未獲得成功（文中未表述），分析是由于重組質(zhì)粒免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)水平不高，導(dǎo)致未能獲得有效分泌MAb 的雜交瘤細(xì)胞株。而通過單個(gè)B 細(xì)胞抗體基因擴(kuò)增技術(shù)卻獲得了Gp90 MAb，提示單個(gè)B 細(xì)胞抗體基因擴(kuò)增技術(shù)對(duì)于抗原誘導(dǎo)抗體效價(jià)的篩選閾值要求較低，因此可有效地縮短免疫周期。

綜上所述，本研究首次采用單個(gè)B 淋巴細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)對(duì)Gp90 MAb 進(jìn)行了篩選并獲得的Gp90 MAb，為基于Env 蛋白的診斷試劑等生物制品的研發(fā)，以及為研究Env 的生物學(xué)特性等提供了重要工具。