范明明，林 偉，韓海瑞，張嘉裕，王 順

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150000)

功能性消化不良(FD)是一種功能性的胃腸道疾病，以上腹部疼痛、燒灼感、餐后飽脹和早飽感中的1項或多項為主要臨床表現(xiàn)，可伴上腹部脹滿、食欲不振、惡心、嘔吐及噯氣，需排除因代謝性、系統(tǒng)性和器質(zhì)性疾病所導致的消化不良[1]。羅馬Ⅳ標準將功能性消化不良分為餐后不適綜合征、上腹痛綜合征以及混合型[2]。中醫(yī)依據(jù)該病臨床特點，將其歸屬于“胃脘痛”“痞滿”等范疇，臨床以肝郁脾虛多見。筆者依據(jù)多年豐富臨床實踐經(jīng)驗，以自擬疏肝健脾方藥對肝郁脾虛證FD患者辨證施治，效果顯著，但其作用機制尚不明確。本研究通過建立肝郁脾虛FD大鼠模型，探討了疏肝健脾法治療FD的可能機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性健康SPF級SD大鼠60只，體重(220±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(黑)2016004。適應性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)期間充足清潔飲水，自由攝食，室溫控制在(22±2)℃，相對濕度維持在55%～60%。

1.2實驗藥物 柴術理胃飲組方：柴胡15 g、黨參20 g、白術15 g、白芍15 g、枳實10 g、陳皮10 g、姜半夏10 g、丹參10 g、砂仁10 g、炙甘草10 g，黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院藥房提供，常規(guī)水煎濃縮至10.8 g/mL后4 ℃冷藏備用。多潘立酮(西安楊森制藥有限公司，國藥準字H20033213，規(guī)格：10 mg/片)，蒸餾水配制成0.3 mg/mL的溶液備用。

1.3主要試劑 P物質(zhì)(SP)抗體(批號：BS-0065R)、胃泌素(GAS)抗體(批號：BS-1189R)、胃動素(MTL)抗體(批號：BS-1445R)、血管活性腸肽(VIP)抗體(批號：BS-0077R)均由北京博奧森提供；內(nèi)參抗體β-actin(wanleibio，WL01845)；TRNzol總RNA提取試劑[天根生化科技(北京)有限公司，DP405-02]。

1.4主要儀器 超速冷凍離心機(湖南湘儀，H-2050R)；凝膠成像系統(tǒng)(北京六一，WD-9413型)；雙垂直蛋白電泳儀(DYCZ-24DN)；分光光度計(Therno Scientific，NANODROP 2000)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，ABI7500)。

1.5實驗方法 將曠場試驗篩選符合標準的60只SPF級雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、柴術理胃飲低劑量組、柴術理胃飲中劑量組、柴術理胃飲高劑量組和多潘立酮組，每組10只。除正常組外，其余組大鼠均采用復合因素刺激(慢性疲勞+懸尾刺激+飲食失節(jié))方法[3]制備FD模型，造模周期為28 d。造模成功后，柴術理胃飲低、中、高劑量組分別給予13.5 g/kg、27 g/kg、54 g/kg柴術理胃飲灌胃，多潘立酮組給予制備的多潘立酮溶液3.125 mg/kg灌胃，正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)21 d。

1.6觀察指標及方法

1.6.1大鼠一般狀態(tài) 記錄各組大鼠實驗過程中的精神狀態(tài)、毛發(fā)情況、活動度、大便性狀等行為學改變。

1.6.2大鼠體重和進食量 造模前和末次灌胃當天用電子秤稱量各組大鼠空腹體重；記錄造模前7 d和灌胃最后7 d時進食量,計算每日平均進食量,分別作為造模前和末次灌胃當天進食量。

1.6.3大鼠胃腸動力 末次灌胃后，大鼠禁食12 h，給予1 mL/100 g碳素墨水灌胃，30 min 后用10%水合氯醛腹腔麻醉。剖腹取胃稱重為全重，然后沿胃小彎側剪開胃壁并沖洗，濾紙吸干后稱重為凈重，計算胃排空率[胃排空率=(全重-凈重)/全重×100%]。截取小腸全段，測量小腸全長和幽門至炭墨上緣距離，計算小腸推進率[小腸推進率=碳墨推進距離/小腸全長×100%]。

1.6.4大鼠胃竇組織病理形態(tài)學觀察 檢測胃腸動力后，取大鼠胃竇組織,放入4%多聚甲醛中固定，然后常規(guī)脫水、浸蠟和包埋，制備4 μm厚切片，HE染色觀察病理學表現(xiàn)。

1.6.5胃竇組織中SP、GAS、MTL、VIP蛋白表達量采用免疫印跡法檢測：采用BCA方法提取胃竇組織中SP、GAS、MTL、VIP蛋白并測定含量，常規(guī)電泳。電泳結束后，將“海綿-濾紙-膜-膠-濾紙-海綿”在80 V電壓下轉(zhuǎn)印1.5 h。轉(zhuǎn)印結束后，將PVDF膜浸入脫脂奶粉溶液中，搖床緩慢搖動1 h結束封閉。1∶500的抗體稀釋液(TBST，5%脫脂奶粉)稀釋一抗，4 ℃條件下孵育過夜；1∶5 000的抗體稀釋液稀釋二抗，37 ℃下孵育45 min。將孵育二抗后的PVDF膜均勻地灑上ECL發(fā)光液，靜置5 min并在暗室進行曝光。將曝光后的PVDF膜浸入蒸餾水中，搖床搖動5 min，重復2次，再加入剝脫液并搖床搖動15 min；將洗滌后的PVDF膜放入蒸餾水中，搖床搖動10 min，重復2次。將抗體剝脫后的PVDF膜浸入TBST中，搖床搖動5 min，緊接著浸入脫脂奶粉溶液中，搖床緩慢搖動1 h進行封閉。按照以上相同步驟孵育內(nèi)參抗體，然后將ECL發(fā)光液均勻地灑在PVDF膜上，靜置5 min并在暗室進行曝光。最后掃描膠片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。

1.6.6胃竇組織中SPmRNA表達量 采用Real Time PCR法檢測：充分研磨胃竇組織，加入TRIzol，室溫保存5 min后加入0.2 mL氯仿并充分混合，室溫放置5 min；12 000 r/min離心15 min后吸取上層水相預冷異丙醇靜置10 min，再次離心15 min后棄掉上清液，加入75% DEPC乙醇離心后靜置并加入DEPC水溶解沉淀完成總RNA提取,紫外分光光度計測定RNA濃度和純度；電泳后進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，將cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。Real Time PCR反應體系：2 × Master Mix共10 μL、SP上游引物0.5 μL、SP下游引物0.5 μL、cDNA 2 μL、水7 μL。引物序列：SP上游引物為5’-ATGAAA ATCCTCGTGGCGGT-3’，下游引物為5’-AATGGGCAAACGGGATGCTG-3’，產(chǎn)物大小210 bp；ACTIN上游引物為5’-CATCTCTTGGAAGT CA-3’，下游引物為5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’，產(chǎn)物大小280 bp。實時熒光定量PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，共40個循環(huán)。再95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃的條件下獲得熔解曲線。β-actin在相同條件下進行實時熒光定量PCR反應并獲取溶解曲線。每個樣本檢測3個復孔，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)分析。

2 結 果

2.1各組大鼠一般狀態(tài) 造模初期，各組大鼠的飲水進食、體重、糞便性狀及皮毛色澤等均正常。造模結束，造模各組大鼠的飲水量和進食量均減少，精神差，皮毛少光澤，體重下降，自主活動顯著減少，稀便，反應力較差。灌胃結束，柴術理胃飲各組和多潘立酮組大鼠飲水量、進食量基本恢復，皮毛光澤，體重緩慢增長，自主活動增多，糞便性狀均正常。

2.2各組大鼠體重及進食量比較 末次灌胃當天，模型組大鼠體重及進食量均明顯低于模型組(P均<0.05)；柴術理胃飲各組和多潘立酮組大鼠體重及進食量均明顯高于模型組(P均<0.05)；各藥物組間進食量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),柴術理胃飲高劑量組大鼠體重明顯高于柴術理胃飲低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 正常組和功能性消化不良各組大鼠體重及進食量比較

2.3各組大鼠胃排空率與小腸推進率比較 模型組大鼠胃排空率及小腸推進率均明顯低于正常組(P均<0.05)，柴術理胃飲各組和多潘立酮組大鼠胃排空率及小腸推進率均明顯高于模型組(P均<0.05)；柴術理胃飲高劑量組大鼠胃排空率明顯高于柴術理胃飲低劑量組(P<0.05)，各藥物組間小腸推進率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃排空率與小腸推進率比較

2.4各組大鼠胃竇組織病理形態(tài)學表現(xiàn) 正常組大鼠胃竇組織結構、細胞排列均正常，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠胃竇黏膜層可見淋巴細胞浸潤；柴術理胃飲各組和多潘立酮組大鼠胃竇黏膜層可見少量淋巴細胞浸潤，浸潤程度輕于模型組。見圖1。

圖1 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織病理形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×100)

2.5各組大鼠胃竇組織中SP、GAS、MTL、VIP蛋白表達情況 與正常組比較，模型組大鼠胃竇組織中SP、GAS、MTL蛋白表達量均明顯降低(P均<0.05)，VIP蛋白表達量明顯增高(P<0.05)。柴術理胃飲中、高劑量組大鼠胃竇組織中SP、GAS、MTL蛋白表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，柴術理胃飲低劑量組和多潘立酮組SP、GAS、MTL蛋白表達量與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；柴術理胃飲各組和多潘立酮組大鼠胃竇組織中VIP蛋白表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)；柴術理胃飲高劑量組SP、GAS、MTL蛋白表達量均明顯高于柴術理胃飲低劑量組(P均<0.05)，VIP蛋白表達量明顯高于柴術理胃飲低劑量組(P<0.05)。見圖2～5。

圖2 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中SP蛋白表達情況

圖3 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中GAS蛋白表達情況

圖4 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中MTL蛋白表達情況

2.6各組大鼠胃竇組織中SP mRNA表達情況 模型組大鼠胃竇組織中SP mRNA表達量明顯低于正常組(P<0.05)；柴術理胃飲各組和多潘立酮組大鼠胃竇組織中SP mRNA表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且柴術理胃飲高劑量組明顯高于柴術理胃飲低劑量組(P<0.05)。見圖6。

圖5 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中VIP蛋白表達情況

圖6 正常組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織中SP mRNA表達情況

3 討 論

目前FD的發(fā)病機制尚不完全清楚，現(xiàn)代醫(yī)學認為與胃腸道運動功能障礙、胃的高敏感性、胃十二指腸低級別炎癥、幽門螺桿菌感染、精神心理因素、腦-腸軸功能紊亂、遺傳易感性等諸多因素密切相關[4-6]。其中腦-腸軸功能紊亂被視為FD發(fā)病的重要核心機制，腦-腸軸是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)連接而成的一種雙向神經(jīng)調(diào)節(jié)回路，主要由分布于其間的腦腸肽(由胃腸激素、胃腸神經(jīng)肽、神經(jīng)肽組成)將整合后的各種信息通過神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡傳遞到胃腸內(nèi)分泌細胞而起到調(diào)節(jié)作用，其中胃腸激素SP、GAS、MTL、VIP分泌紊亂與FD的發(fā)生密切相關[7-9]。

SP是由11個氨基酸組成的神經(jīng)肽，作為主要的興奮性非膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)，能促進乙酰膽堿釋放，從而誘導胃腸道平滑肌收縮。腸道低度炎性狀態(tài)下可刺激SP釋放，增加內(nèi)臟敏感性并加速胃腸蠕動，且可以下調(diào)炎癥因子來減輕腸損傷，維持腸黏膜屏障完整性[10-12]。GAS由存在于胃竇和十二指腸內(nèi)的G細胞分泌，也存在于垂體和大腦皮質(zhì)中，并受中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)調(diào)節(jié)。其主要生理功能是促進胃酸分泌，刺激胃腸道黏膜增生并起營養(yǎng)保護作用，加強胃腸道運動，此外還可以加速胃電節(jié)律，促進胃竇和幽門括約肌收縮[13-15]。在緊張焦慮等環(huán)境下，血清GAS含量降低[16]。MTL主要是由M細胞合成分泌，能夠啟動胃腸移行性肌電復合波(MMC)Ⅲ相，提高胃腸道平滑肌細胞內(nèi)Ca2+濃度，促進胃蛋白酶分泌，可加速腸胃蠕動及胃排空[17]，還可作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)參與焦慮等行為及情緒的整合[18]。VIP分布于中樞神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中，其既是一種胃腸道激素，又是一種非腎上腺能非膽堿能神經(jīng)抑制系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，能夠松弛胃腸道平滑肌，延遲胃排空，抑制胃液分泌[19]；徐派的等[20]研究報道，肝郁脾虛型FD大鼠下丘腦、胃竇、空腸中VIP表達明顯增高。本實驗結果顯示，肝郁脾虛型FD大鼠模型胃排空率和小腸推進率降低，胃竇組織中SP、GAS、MTL蛋白表達均下降，VIP蛋白表達增加，與既往研究結論一致。

柴術理胃飲由柴胡疏肝散、小建中湯、香砂六君子湯加減而成，其中柴胡疏肝氣而調(diào)達肝木，白術補氣健脾，二者相合肝郁解而脾旺。黨參補中益氣、健脾益肺，與白術相伍補脾胃之虛；枳實、陳皮理氣健脾、行氣和胃，與白術、黨參相伍補而不滯；白芍養(yǎng)血柔肝，緩急止痛。姜半夏燥濕化痰，降逆消痞；砂仁芳香醒脾化濕，行氣和胃；丹參活血祛瘀止痛，甘草調(diào)和諸藥。全方具有疏肝解郁、益氣健脾之功。曹峰等[21]動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，高劑量柴胡可明顯提高胃竇組織中MTL含量，增強胃腸動力。相關藥理研究發(fā)現(xiàn)，白芍可以降低胃腸VIP含量，促進胃排空[22]；白術能修復胃腸黏膜損傷[23]；黨參具有抑制胃酸分泌、修復胃黏膜等作用[24]；陳皮可提高大鼠血清GAS水平，促進胃平滑肌收縮和消化液分泌[25]；枳實提取物能增強胃動力和加速腸蠕動[26]；丹參水溶性成分能夠增加胃黏膜血流，保護黏膜屏障[27]；砂仁能抑制胃酸分泌，調(diào)節(jié)腸道菌群，加快胃腸蠕動[28]。本實驗結果顯示，柴術理胃飲各組大鼠胃排空率及小腸推進率均明顯高于模型組，柴術理胃飲中、高劑量組大鼠胃竇組織中SP、GAS、MTL蛋白表達量和柴術理胃飲各組SP mRNA表達量均明顯高于模型組，柴術理胃飲各組胃竇組織中VIP蛋白表達量均明顯低于模型組，提示柴術理胃飲干預能增強肝郁脾虛型FD大鼠胃排空和小腸推進功能，上調(diào)胃竇組織中SP、MTL、GAS表達，下調(diào)VIP表達。

綜上所述，疏肝健脾法可以促進肝郁脾虛型FD大鼠胃腸蠕動，上調(diào)胃竇組織中SP、GAS、MTL表達和下調(diào)VIP表達可能是其改善胃腸動力障礙的重要機制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。