周 娟，林曉玲，劉 華，葉麗妍，陳佩文，葉綺娜，陳曉剛

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；3.廣州婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623)

支氣管哮喘是以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的過敏性疾病，以兒童多見。目前現(xiàn)代醫(yī)學對哮喘的治療仍然以霧化吸入糖皮質(zhì)激素為主，然而過量吸入糖皮質(zhì)激素可能會造成藥物依賴或耐藥性以及其他不良反應。此外，哮喘疾病病程較長，患兒的用藥依從性較差，亦會影響治療效果。中醫(yī)藥治療哮喘顯示出較好效果，如景曉平等[1]研究報道，中藥治療可降低哮喘發(fā)作次數(shù)、整體調(diào)節(jié)患兒免疫力。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，“培土生金法”早期干預能顯著減輕哮喘模型幼鼠的氣道炎癥反應，增加支氣管肺泡灌洗液中白細胞介素-10(IL-10)的含量[2]。本實驗探討了“培土生金法”的上述作用機制是否與調(diào)節(jié)腸道微生物的構成相關，旨在為中醫(yī)藥防治哮喘的作用機制研究提供更多的實驗證據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 7日齡SPF級BALB/c雌性幼鼠32只，體重(5.26±1.15)g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK(粵)2018-0034。飼養(yǎng)環(huán)境：廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心SPF級環(huán)境，實驗中心許可證號：SYXK(粵)2018-0092，實驗符合廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理審查要求。

1.2藥品、試劑與儀器 雞卵清蛋白(OVA，Sigma公司)；氫氧化鋁粉(天津天士力化學試劑公司)；異功散組方：人參、白術、茯苓、廣陳皮、炙甘草(廣州中醫(yī)藥中大學第一附屬醫(yī)院)按1∶1∶1∶1∶1比例配制成含生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL的溶液；酪酸梭菌(CGMCC313-1，山東科興生物制品有限公司)；霧化器(廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科)；小鼠霧化激發(fā)箱(廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心)。

1.3實驗方法 按隨機數(shù)表法將幼鼠分為空白組、模型組、異功散組和益生菌組，每組8只，分籠喂養(yǎng)。模型組、異功散組和益生菌組參照文獻[2]方法制備幼鼠哮喘模型：幼鼠分別于第1天、第13天腹腔注射0.2 mL OVA致敏液(質(zhì)量分數(shù)為10% OVA溶液0.1 mL與等體積佐劑液態(tài)鋁混合)，并于第19天開始以3% OVA溶液霧化吸入激發(fā)，每次20 min，每日1次，連續(xù)激發(fā)6 d，幼鼠出現(xiàn)煩躁不安、腹部凹陷、搔耳撓鼻、弓背為陽性反應；空白組以等體積生理鹽水行腹腔注射致敏及霧化吸入激發(fā)。從造模起始日至霧化激化前1 d(共18 d)，異功散組給予異功散煎液灌胃，益生菌組給予濃度為5×108CFU/mL的酪酸梭菌溶液灌胃，空白組和模型組給予PBS溶液灌胃，均每日1次，0.2 mL/只。

1.4觀察指標及方法

1.4.1幼鼠表現(xiàn)及體重 觀察幼鼠激發(fā)階段表現(xiàn)，實驗結束后記錄各組幼鼠體重。

1.4.2腸道菌群檢測 實驗結束后，解剖各組幼鼠取全結腸，收集糞便，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。樣本送至上海銳翌生物科技有限公司行16S-rRNA擴增子高通量檢測及相應的生物信息學分析。

2 結 果

2.1各組幼鼠激發(fā)階段表現(xiàn)及體重比較 模型組幼鼠在激發(fā)階段期間出現(xiàn)搔耳撓鼻、前肢上抬、煩躁、活動過度活躍(跑竄、攀爬等行為)、腹部凹陷等表現(xiàn)；異功散組和益生菌組幼鼠偶有搔耳撓鼻行為，無明顯其他異常表現(xiàn)。實驗結束后，空白組、模型組、異功散組、益生菌組幼鼠體重分別為(16.34±0.89)g、(13.33±1.98)g、(13.85±1.72)g、(14.59±1.64)g，模型組明顯低于空白組(P<0.05)，異功散組、益生菌組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，益生菌組與異功散組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2各組幼鼠腸道菌群情況

2.2.1微生物菌群物種豐度 門水平：與空白組比較，模型組幼鼠腸道內(nèi)的擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度減少，厚壁菌門(Firmicutes)豐度增加；與模型組比較，異功散組、益生菌組的擬桿菌豐度增加，厚壁菌門豐度減少，見圖1。屬水平：空白組產(chǎn)丁酸鹽菌屬(Saccharibacteria-genera-incertae-sedis)比例顯著增加，模型組中阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)比例顯著增加，異功散組螺桿菌屬(Helicobacter)、黃酮菌屬(Flavonifractor)比例顯著增加，益生菌組中腸桿菌屬(Enterorhabdus)、羅氏菌屬(Rothia)、戴爾福特菌屬(Delftia)比例顯著增加，見圖2。

圖1 空白組和哮喘各組幼鼠門水平上微生物菌群物種豐度

2.2.2腸道菌群物種alpha多樣性分析 各組幼鼠腸道菌群的稀釋曲線均急劇上升后呈平緩趨勢(見圖3)，表明測序深度可以覆蓋本樣本中的物種組成情況。與空白組比較，模型組幼鼠腸道菌群豐度chao1指數(shù)及observed_species指數(shù)和菌群多樣性shannon指數(shù)及simpson指數(shù)均有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。與模型組比較，異功散組幼鼠腸道菌群的豐度chao1指數(shù)明顯降低(P<0.05)，菌群多樣性指數(shù)有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；益生菌組幼鼠腸道菌群豐度chao1指數(shù)及observed_species指數(shù)有下降趨勢，菌群多樣性shannon指數(shù)及simpson指數(shù)有增加趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和哮喘各組幼鼠腸道微生物菌群豐富度和多樣性比較

圖3 空白組和哮喘各組幼鼠腸道菌群的稀釋曲線

2.2.3Beta多樣性分析各組樣本的主成分分析(PCA) 空白組、模型組、異功散組及益生菌組在第1主成分(14.68%)及第2主成分(10.78%)可分離，說明各組菌群組成存在一定的差異，見圖4。

圖4 空白組和哮喘各組幼鼠腸道菌群樣本的主成分分析

2.2.4微生物組間差異分析 在門水平上，空白組幼鼠腸道菌群以CandidatusSaccharibacteria為主，模型組以疣微菌門(Verrucomicrobia)為主，異功散組以擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)為主；在屬水平上，空白組主要為產(chǎn)丁酸鹽菌屬(Saccharibacteria-genera-incertae-sedis)、球菌屬(Sporosarcina)、巴氏桿菌屬(Pasteurella)，模型組主要為阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、擬普雷沃菌屬(alloprevotella)，異功散組主要為螺桿菌屬(Helicobacter)、黃酮菌屬(Flavonifractor)、Erysipelotrichaceae-incertae-sedis，益生菌組主要為腸桿菌屬(Enterorhabdus)、短小桿菌屬(Curtobacterium)。見圖5及圖6。

圖5 空白組和哮喘各組幼鼠腸道菌群進化分支

圖6 空白組和哮喘各組幼鼠腸道菌群 LDA值分布情況

3 討 論

近年來越來越多的證據(jù)表明，嬰兒早期腸道微生物的組成及改變與過敏性哮喘發(fā)生密切相關[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，出生后第1個月腸道菌群多樣性降低可導致學齡期哮喘的發(fā)生[3]；3個月嬰兒腸道的低水平Faecalibacterium、Lachnospira、V feillonella和Rothia菌群與哮喘發(fā)生風險呈正相關[5]。腸道菌群的失調(diào)雖可能導致哮喘的發(fā)生，但特定的微生物物種在哮喘的發(fā)展中亦起保護作用，口服益生菌被認為是防治哮喘的有效治療手段。動物實驗表明，口服酪酸桿菌、短雙歧桿菌M-16V可減輕OVA導致的小鼠過敏性氣道炎癥[6]；一項隨機對照試驗的Meta分析結果顯示，補充鼠李糖乳桿菌GG有助于預防哮喘[7]。

中醫(yī)認為，哮喘的夙根為“痰”，哮喘緩解期以脾肺氣虛證多見?！侗氪橐分杏涊d：“喘一小兒外感風邪，服表散之劑，汗出作喘，此邪氣去而脾肺虛也。用異功散而汗喘止，再劑而乳食進?！碑惞ι⑹潜彼蚊t(yī)錢乙所制名方，由人參、白術、茯苓、陳皮、炙甘草組成，人參益氣補中，白術健脾燥濕，茯苓健脾滲濕，陳皮行氣燥濕，甘草甘緩和中，全方健脾益氣、行氣化滯，在哮喘患兒緩解期的治療中得到大量應用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，方中主要藥物的活性成分如橘皮素、橙皮苷、人參皂苷Rh2等，能減輕哮喘模型動物肺組織炎癥，或降低氣道高反應性，抑制Th2、Th17細胞增殖及相關炎性因子分泌等[8-9]。

本實驗中采用16S-rRNA擴增子高通量測序技術檢測哮喘幼鼠腸道菌群情況，結果顯示模型組腸道菌群豐度和菌群多樣性有下降趨勢，異功散和益生菌的早期干預并未使菌群結構發(fā)生顯著改變，提示二者未能有效逆轉(zhuǎn)哮喘幼鼠腸道菌群物種豐度及多樣性的下降，這可能與用藥時間較短(18 d)有關，也提示藥物的作用可能只局限于某些特定菌群。

擬桿菌是腸道內(nèi)棲息的常見共生菌，是腸道產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)尤其是乙酸的主要細菌來源[10]，而乙酸可有效改善過敏性哮喘[4]。Abrahamsson等[3]研究發(fā)現(xiàn)，腸道擬桿菌豐度高的嬰幼兒以后患哮喘和過敏性疾病的概率相對較低；相關動物實驗提示，腸道擬桿菌有助于減輕哮喘模型小鼠的過敏性炎癥及氣道高反應性[4，11]。本實驗結果顯示，與空白組比較，模型組幼鼠腸道內(nèi)的擬桿菌門豐度減少，厚壁菌門豐度增加；與模型組比較，異功散組、益生菌組的擬桿菌豐度增加，厚壁菌門豐度減少。提示異功散早期干預可能通過改變腸道菌群中擬桿菌門豐度從而改善哮喘。

幽門螺桿菌被認為可防治哮喘。美國一項大型橫斷面分析結果顯示，幽門螺桿菌的定植與哮喘發(fā)生呈負相關，在5歲以下尤為明顯[12]。動物實驗研究表明，在致敏前期暴露于幽門螺桿菌可顯著改善OVA致敏哮喘小鼠的氣道炎癥，抑制氣道重塑[13]，其誘導的保護作用包括通過IL-18和IL-10依賴性機制誘導耐受性樹突狀細胞和調(diào)節(jié)性T細胞[14-16]。黃酮菌屬中的Flavonifractorplautii(FP)為革蘭陽性厭氧菌，可從人類糞便中分離出來，參與人腸道中兒茶素的代謝，兒茶素被認為可減輕哮喘小鼠的氣道炎癥[17]。動物實驗結果顯示，口服FP可抑制OVA致敏小鼠的脾臟細胞分泌IL-4，減少血清中OVA-sIgE的含量，并增加CD4+CD25+T細胞和CD103+CD11c+樹突狀細胞，減輕抗原誘導的Th2免疫應答[18]。本實驗結果顯示，異功散組中螺桿菌屬、黃酮菌屬較模型組顯著增加，提示異功散早期干預可能通過影響螺桿菌屬、黃酮菌屬而發(fā)揮治療哮喘作用。

綜上所述，異功散的早期干預影響了哮喘模型幼鼠的腸道菌群，其防治哮喘作用可能與某些關鍵菌群如擬桿菌、螺桿菌、黃酮菌等相關，但其具體機制尚需進一步深入探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。