譚 晶,欒海艷,張慧明,王 琳,王李鳴,鄭小鵬,孫 躒,單洪超,江智慧,辛 華

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一[1]，也是世界范圍內的一個重大公共衛(wèi)生問題。據統(tǒng)計全球約有 4.2億的糖尿病患者，平均每4名女性和每5名男性中就有1名患有2型糖尿病糖尿病腎病，這種現象在1型糖尿病中更為常見[2]。近年來，隨著人們生活質量的提高，糖尿病的發(fā)病率在全世界范圍內更是呈現突飛猛進的上升現象。約20%～30%的2型糖尿病(T2DM)患者有腎功能損害。在高血糖的持續(xù)刺激狀態(tài)下，腎小球腎小管功能收到破壞。糖尿病患者胰島素分泌不足，導致機體產生大量且穩(wěn)定的糖基化終末產物(Advanced Glycation End products, AGEs)。AGEs在腎臟中的沉積導致腎小球基底膜逐漸變厚，系膜細胞大量增殖，腎小球硬化，腎間質出現纖維化等病變，同時引起基底膜增厚，細胞受損，腎小球濾過率增加。AGEs具有比高糖更強的胰島β細胞毒性作用，是導致糖尿病持續(xù)惡化的重要因素。另一方面，AGEs大量積累，促進炎癥因子釋放，激活炎癥反應，進一步促進糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。糖尿病腎病主要臨床表現為蛋白尿、水腫、高血壓、腎衰竭、貧血，同時會引起心肌梗死、神經源性膀胱炎等并發(fā)癥。有研究表明[3]，糖尿病晚期100%并發(fā)視網膜病變，并伴隨其病程加速視網膜惡化。糖尿病腎病患者常常合并代謝綜合征，高血糖，高血脂癥、高尿酸癥等代謝疾病又進一步加重腎臟損傷，導致糖尿病腎病患者的5年生存率低于20%[4]。嚴重影響患者生活及生存質量。DN的致病因素和發(fā)病機制主要代謝紊亂、遺傳因素、氧化應激、炎癥影響等[5]。糖尿病腎病是由于胰島素分泌不足或細胞對胰島素反應無效而引起的腎臟微血管并發(fā)癥，是終末期腎臟疾病的主要病因[6]。目前，治療方法主要為藥物治療，其中以胰島素注射治療為主。這一疾病尚不能完全治愈，只能緩解相關癥狀及并發(fā)癥，也不能改善糖尿病腎病病變的最終結果[7]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，芯片技術已經成為醫(yī)學研究領域的重要研究手段之一，大量的基因芯片數據為臨床治療提供了更多可靠的治療依據。本研究從Gene Expression Omnibus數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載編號為“GSE30122”、“GSE142153”的芯片數據，采用R語言(https://www.r-project.org/)中GEO query包下載GEO芯片矩陣及臨床信息。其中，GSE30122芯片數據的原始文件有69個樣本，健康組50例，糖尿病腎病組19例，所有樣本全部為腎組織，并采用“GPL570”平臺進行檢測。GSE142153芯片數據的原始文件有40個樣本，其中健康組10例，糖尿病腎病組23例，終末期糖尿病腎病7例，去除終末期糖尿病腎病后，對其余33例樣本進行分析，所有樣本全部為外周血，并采用“GPL6480”平臺進行檢測。

1.2 方法

1.2.1 差異基因

采用eBayes檢驗，通過R語言中Limma包對合并數據集進行差異分析，選取|logFC|>0.4。正常應該采用|logFC|>1，由于聯(lián)合了不同的數據集，通過去批次效應后，會將部分差異基因|logFC|值降低，直接使用|logFC|>1，差異基因數較少。因此采取|logFC|>0.4，P<0.05為閾值。

1.2.2 KEGG通路富集

將“1.2.1”項下獲取差異基因以gene symbol及l(fā)ogFC導入R，使用富集的clusterProfiler、ID轉換的org.Hs.eg.db和繪圖的ggplot2等加載包進行分析，以pvalueCutoff≤0.05和qvalueCutoff ≤0.05進行篩選。

2 結果

2.1 差異基因分析

通過limma包進行差異分析，共得到251個差異基因，其中上調基因174個，下調基因77個，對差異分析結果進行繪制火山圖，紅色部分為上調基因，綠色部分為下調基因，黑色部分為無差異基因，見圖1；按|logFC|進行排序，選取前50個差異基因進行熱圖繪制可知，GSE30122、GSE142153采集樣本為腎臟和外周血，結果顯示前50個差異基因中，健康組和糖尿病腎病組存在一定差異，見圖2。

圖1 差異基因火山圖(up: 上調基因；down: 下調基因；stable: 無差異基因)

圖2 差異基因熱圖

2.2 KEGG通路富集分析

通過對差異基因KEGG通路富集分析，共得到37條KEGG通路富集結果，表明糖尿病腎病發(fā)病主要與Rheumatoid arthritis、Pertussis、NF-kappa B 等信號通路有關，見圖3。

圖3 KEGG通路富集分析結果圖(A.氣泡圖；B.弦表圖)

由圖3 A-B可知，Rheumatoid arthritis信號通路主要有CXCL6、CCL5、ITGB2等12個基因參與，Pertussis信號通路主要有IL1B、LY96、IRF8等10個基因參與，NF-kappa B 信號通路主要有CXCL3、LTB、IL1B等11個基因參與。通過圖4可知，Rheumatoid arthritis、Pertussis、NF-kappa B 信號通路等具有相同的基因。使用pathview加載包對通路關系圖中關聯(lián)度度值較高的結果進行染色，見圖5。由圖5 A-D可知，4條信號通路相互影響，除PLCy2基因為下調基因，其余都為上調基因。KEGG結果表明DN發(fā)病機制并非單一的，而是多靶點-多通路共同導致的。

圖4 通路-基因網絡圖

圖5 KEGG通路富集結果染色圖(A.Staphylococcus aureus infection信號通路；B.Rheumatoid arthritis信號通路；C.NF-kappa B 信號通路；D.TNF 信號通路)

3 討論

本研究通過GEO數據庫下載GSE30122數據，經過limmma包中normalizeBetweenArrays函數進行標準化，得到中位數齊，樣品分布均勻，密度統(tǒng)一的質量分析結果。將GSE142153和GSE30122數據集進行合并，去除批次效應，使用limma包共獲取251個差異基因，其中174個上調基因，77個下調基因。對差異基因進行KEGG富集分析，共得到37條KEGG通路富集結果。

分析結果顯示，糖尿病腎病發(fā)病機制與Rheumatoid arthritis、Pertussis、NF-kappa B 等信號通路有關，Rheumatoid arthritis信號通路主要有CXCL6、CCL5、ITGB2等12個基因參與，Pertussis信號通路主要有IL1B、LY96、IRF8等10個基因參與，NF-kappa B 信號通路主要有CXCL3、LTB、IL1B等11個基因參與。通過可視化分析后的結果表明，糖尿病腎病發(fā)病機制是由多條通路相互影響導致的，發(fā)病機制復雜，需要多靶點-多通路綜合分析。對統(tǒng)計結果的前10條通路進行關聯(lián)性分析發(fā)現，影響最大的為炎癥信號通路的相關基因，多種炎性因子介導的炎癥反應有可能是造成血管內皮功能減退和腎小球內皮細胞損害的重要因素之一，是糖尿病腎病發(fā)病的重要機制。

糖尿病腎病是2型糖尿病患者發(fā)病和死亡的主要原因之一，也糖尿病患者發(fā)展為終末期腎病的主要原因。氧化和炎癥損傷在糖尿病腎病的發(fā)病機制中起重要作用，病理上可見腎小球基底膜增厚等病變，臨床上主要表現為白蛋白排泄增加和腎小球濾過率降低。因此，嚴格的控制血糖和血壓是治療糖尿病的重點，炎癥的相關治療可以有效地保護腎功能正常運行，延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。糖尿病腎病及其并發(fā)癥的治療尚未完全被人類所掌握，很大比例的糖尿病患者發(fā)展為終末期腎病，最后需要透析治療，給患者及其家庭帶來很多心理和經濟上的壓力。在尋找該疾病的潛在靶點和藥物研究上我們還需進一步研發(fā)和開創(chuàng)，需要新的治療方案，我們相信終有一天能攻克難關，為糖尿病腎病患者帶來很多希望。