孫藝萌，李子昂，王 娜，凌欣宇，王選杰，曲 鵬，楊利敏

(1.大連大學醫(yī)學院，遼寧 大連 116622；2.河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050017)

糖尿病(DM)尤其是2型糖尿病是目前最常見的慢性非傳染病之一，發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢，最值得關(guān)注的是DM 患者易并發(fā)心理疾病[1]。最新流行病學調(diào)查顯示，DM患者并發(fā)抑郁癥的發(fā)病率為28%，亞洲糖尿病合并抑郁癥的發(fā)病率更高，為32%，約是正常人患抑郁癥的3倍以上[2]。從臨床數(shù)據(jù)來看，二者共病會使DM 患者出現(xiàn)長期焦慮、抑郁、更甚者會出現(xiàn)過激行為，導(dǎo)致患者死亡率增加[3]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病與抑郁癥在發(fā)病機理方面存在較強的相關(guān)性[4,5]，尤其是在炎癥反應(yīng)方面。近期研究發(fā)現(xiàn)糖尿病和抑郁癥均伴隨有炎性因子水平升高的現(xiàn)象，但炎性因子在糖尿病并發(fā)抑郁癥中的作用尚不十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素-18(IL-18)作為炎性反應(yīng)中重要的炎性因子，廣泛參與了糖尿病和抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程[6, 7]，本研究通過觀察慢性不可預(yù)知性刺激對糖尿病大鼠TNF-α和IL-18水平的影響，初步探討炎癥反應(yīng)在糖尿病并發(fā)抑郁癥病理機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量250～300g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲水，晝夜節(jié)律正常，明暗周期為12h，環(huán)境溫度25℃，濕度保持在55%左右。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始制備動物模型。將30只大鼠隨機分為3組，分別為正常組(Control組)10只，糖尿病模型組(DM組)10只，糖尿病合并抑郁癥組(DM+UCMS組)10只。

1.2 動物模型的制備

DM大鼠模型的制備：在進行實驗前，將大鼠預(yù)養(yǎng)一周，并給予UCMS組與DM+UCMS組大鼠高脂高糖飲食一周，在造模前24h之內(nèi)對大鼠進行禁食不禁水處理，一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(2% STZ,溶于配制的0.1mol/L,pH=4.45 檸檬酸緩沖中35mg/kg)，其他組不做處理。造模72h后，對各組大鼠禁食12h，并空腹測量大鼠血糖，DM模型組對大鼠的要求為空腹血糖≥11.1mmol/L，高脂高糖飲食繼續(xù)喂養(yǎng)(比例為面：糖：油：雞蛋=1：0.4:0.3:0.2)，UCMS+DM組必須單籠喂養(yǎng)，DM組和正常組可處群居狀態(tài)。DM+UCMS大鼠模型的制備：本實驗采用高脂高糖飲食聯(lián)合尾靜脈注射 2% STZ、結(jié)合不可預(yù)知慢性刺激的方法建立糖尿病合并抑郁癥動物模型，即 DM+UCMS 組大鼠模型，慢性不可預(yù)知性刺激包括8種：電擊足底30min，禁食40h，禁水24h，4℃冰水游泳5min，45℃熱刺激5min，黑白顛倒24h，無刺激24h，夾尾1min。每天隨機給予大鼠以上8種刺激中的一種，慢性溫和不可預(yù)知性刺激持續(xù)28d。

1.3 模型制備成功標準

DM模型制備成功標準為實驗后大鼠空腹血糖≥11.1mmol/L[12]，進食減少且體重降低，飲水量及尿量明顯增加，部分大鼠可能會出現(xiàn)易怒狀態(tài)。

DM+UCMS模型制備成功標準為實驗后大鼠游泳和掙扎時間明顯縮短，漂浮時間明顯增加，毛色暗沉，部分大鼠可能出現(xiàn)爛尾情況；大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L。

1.4 指標檢測

1.4.1 強迫游泳實驗(FST)

分別將對照組、DM組、DM+UCMS組大鼠進行強迫游泳，檢測其行為學指標。根據(jù)文獻描述[8]，在慢性刺激結(jié)束后對大鼠進行強迫游泳實驗，該實驗由兩部分組成，強迫游泳24h前給予大鼠15min預(yù)游泳，使其適應(yīng)游泳環(huán)境，24h后監(jiān)測大鼠6min游泳行為，統(tǒng)計大鼠漂浮時間、游泳時間和掙扎時間。將大鼠放進水溫為23～25℃，長348mm，寬348mm，高445mm的有機玻璃水箱中，使大鼠后肢不能靠玻璃水箱底部支撐身體。每一只大鼠都需更換干凈清潔的水，防止糞便等物質(zhì)干擾大鼠游泳行為。游泳結(jié)束后，擦干大鼠，放回籠內(nèi)。本實驗使用購于成都泰盟軟件有限公司FST-100睡眠剝奪與強迫游泳實驗系統(tǒng)。

1.4.2ELISA法檢測血清TNF-α和IL-18水平

內(nèi)眥靜脈采血法采取DM組、DM+UCMS組、正常組大鼠空腹全血。10000rpm離心10min后取上清，分裝保存于-20℃冰箱，避免反復(fù)凍融。應(yīng)用ELISA法測定大鼠血清TNF-α和IL-18水平，全自動酶標儀檢測樣本OD值，計算濃度，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，ELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，貨號分別為EK0526和EK0393。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用prism軟件，多組間比較采用單因素方差分析、組間比較采用Tukey檢驗；行為學實驗前后數(shù)據(jù)采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量的變化情況

隨著各種刺激的不斷進行，與對照組大鼠比較，實驗組的大鼠體重都有顯著的變化，其中DM+UCMS組大鼠的體重最低，其次是DM組大鼠，慢性刺激對大鼠的飲食、情緒、行為等方面產(chǎn)生了一定的影響，使DM組大鼠的病情加重，身體狀態(tài)不斷下降，體質(zhì)量也持續(xù)降低。統(tǒng)計學差異顯著(*P<0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化

2.2 實驗前后大鼠強迫游泳指標變化

于制備模型后第4周末對對照組、DM組、DM+UCMS組大鼠進行強迫游泳，觀察并記錄大鼠上竄時間和不動時間的變化。與實驗前相比，DM組和DM+UCMS組大鼠的上竄時間普遍顯著減少(P<0.001)，DM+UCMS組上竄時間減少更明顯；DM組和DM+UCMS組實驗后的不動時間明顯延長(P<0.05和P<0.001)，其中DM+UCMS組不動時間延長更顯著，而對照組實驗前后強迫游泳數(shù)據(jù)并無明顯改變，表明慢性刺激加重了DM大鼠的抑郁樣表現(xiàn)，見圖2。

圖2 各組大鼠實驗前后強迫游泳指標

2.3 各組大鼠空腹血糖水平

與對照組相比較，DM組和DM+UCMS組大鼠空腹血糖明顯升高(P<0.001)，DM組與DM+UCMS組之間并無顯著差異(P>0.05)；同樣的結(jié)果也見于血清胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)，即DM組與DM+UCMS組大鼠血清胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)均較對照組明顯升高(P<0.001)，但DM組與DM+UCMS組之間并無顯著性差異，見圖3。

圖3 各組大鼠血糖、血清胰島素及胰島素抵抗指數(shù)

2.4 各組大鼠血清中TNF-α和IL-18的水平

ELISA結(jié)果顯示，DM和DM+UCMS組大鼠的血清TNF-α和IL-18水平明顯高于對照組(P<0.001)；與DM組相比，DM+UCMS組大鼠血清TNF-α和IL-18水平升高更明顯(P<0.05)，其中DM+UCMS組大鼠血清IL-18較DM組升高具有非常顯著性意義(P<0.001)，由此可見，IL-18與慢性刺激誘發(fā)糖尿病大鼠抑郁行為之間具有密切的相關(guān)性，有可能成為評估糖尿病并發(fā)抑郁癥的一個血清學指標，見圖4。

圖4 各組大鼠血清中TNF-α和IL-18的水平

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計的數(shù)據(jù)顯示，預(yù)估糖尿病的患病人群在2025年將上升至3億[1]。糖尿病常帶來許多的社會問題及各種心理障礙，其中最常見的就是抑郁癥。近年來，國內(nèi)外已有多位學者對糖尿病患者的抑郁情況以及影響因素進行研究，研究人員發(fā)現(xiàn)[9]，糖尿病患者中約有30%患抑郁癥，而正常人群中抑郁癥患病率僅約3.8 %。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并抑郁癥的患者在臨床中的發(fā)病率高，導(dǎo)致患者對自我管理的有效性降低，增加了并發(fā)癥的發(fā)生概率，提高了患者的致殘率、致死率[10]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥和糖尿病患者中炎性細胞因子(IL-18、TNF-α)均升高[6, 7]。本研究結(jié)果亦顯示，DM大鼠血清TNF-α和IL-18均明顯高于對照組，而且慢性不可預(yù)知性刺激雖然對DM大鼠血糖、血清胰島素及胰島素抵抗指數(shù)無影響，但卻可導(dǎo)致DM大鼠血清TNF-α和IL-18水平進一步升高，同時亦可導(dǎo)致DM大鼠抑郁樣行為加重。本研究數(shù)據(jù)顯示，慢性刺激對IL-18水平的影響更顯著，說明 IL-18很可能是慢性刺激誘發(fā)DM大鼠并發(fā)抑郁癥的關(guān)鍵因素，血清IL-18水平很可能是一個可以用來預(yù)測DM并發(fā)抑郁癥的生物標記物，但其病理生理機制尚有待于進一步的實驗研究加以確定。