梁煒杰 張耀偉 王永佳 翁佳雯 鄭奕琳 丁軼

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科（廣州 510515）

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。2020年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例為193.16萬，死亡病例為93.52 萬，分別位于所有惡性腫瘤的第三位和第二位［1］。新增病例多發(fā)生于西方國家。然而在我國，結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)也呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，2020年中國癌癥數(shù)據(jù)顯示結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率分別位居我國第二位和第五位，嚴(yán)重威脅著人民的健康［2］。因此，提高結(jié)直腸癌的治療有效率成為了一個迫切的問題。為了實現(xiàn)結(jié)直腸癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療，必須全面了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制。雖然結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜多級的過程，但其實有跡可循，從正常腸組織發(fā)展到腺瘤再發(fā)展為癌組織，其中涉及到基因突變的累積，內(nèi)環(huán)境的變化以及多條信號通路的異常激活或者抑制［3-5］。通過了解結(jié)直腸癌的分子機制，可以尋找適合的生物靶點，開發(fā)對應(yīng)靶向藥物。在結(jié)直腸癌的生長過程中，會發(fā)生細胞的代謝重編程，為其旺盛的增殖速度與細胞遷移行為提供充足的能量，而這一過程的中樞則是線粒體［6-7］。線粒體掌控著腫瘤細胞的能量和代謝，而線粒體相關(guān)蛋白往往在腫瘤的增殖、遷移、凋亡等過程發(fā)揮著重要作用［8-9］。

線粒體相關(guān)細胞凋亡誘導(dǎo)因子3（apoptosis inducing factor mitochondria associated 3，AIFM3）是線粒體中依賴Caspase 凋亡途徑的關(guān)鍵因子，可介導(dǎo)細胞色素C 從線粒體釋放入胞質(zhì)［10］。既往研究發(fā)現(xiàn)AIFM3 參與了肝細胞癌的增殖和凋亡過程［11］，但AIFM3 與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是否存在關(guān)聯(lián)，目前國內(nèi)外還鮮有報道。通過前期研究以及數(shù)據(jù)分析，筆者發(fā)現(xiàn)AIFM3 在結(jié)直腸癌中表達異常，同時與患者預(yù)后存在相關(guān)性。本研究擬分析AIFM3 的表達與結(jié)直腸癌組織類型和預(yù)后的關(guān)系，以及觀察AIFM3 對結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移等行為的影響，探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 測序數(shù)據(jù) 生物信息學(xué)分析所用的測序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)來源于The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù) 據(jù) 庫（https：∕∕portal.gdc.cancer.gov∕）和GENE EXPRESSION OMNIBUS（GEO）數(shù)據(jù)庫（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕geo∕）。

1.1.2 細胞與組織 結(jié)腸癌細胞系HCT116和SW620均購自（American Type Culture Collection）ATCC 細胞庫，由我系液氮凍存。沉默AIFM3基因的慢病毒及其相應(yīng)的對照載體購于吉凱公司（上海，中國）。shRNA 序列如下：shAIFM3：5'-CCAAGACTCTGAGCTGCAA-3'。轉(zhuǎn)染后，利用嘌呤霉素（Sigma，美國）進行篩選獲得穩(wěn)定細胞株。收集南方醫(yī)院2017-2019年17 例結(jié)直腸癌患者石蠟標(biāo)本，每一例標(biāo)本均包含癌組織與正常腸黏膜組織（即距離癌組織10 cm 以外的正常腸黏膜組織）。

1.1.3 試劑與儀器 CCK-8 試劑來自日本同仁公司，F(xiàn)alcon Transwell 小室來自美國BD 公司。qRTPCR 檢測所用引物是利用Primerbank 網(wǎng)頁和NCBI網(wǎng)頁設(shè)計，由銳博生物公司代為合成。引物序列如下：AIFM3-F：5'-CCAGGAGGGAAAGCTGAAGG-3'；AIFM3-R：5'-CCTGGGACATTGGTCTGCAT-3'；GAPDH-F：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；GAPDH-R：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；TRIzol、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒均來自TAKARA 公司。全蛋白提取試劑盒來自南京凱基生物有限公司。GAPDH、β-actin 抗體購自Abcam 公司；AIFM3、STAT3、p-STAT3、JAK1、JAK2抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 所有細胞均用含有10%胎牛血清、100 U∕mL 青霉素和100 μg∕mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用Lipo2000，將重組慢病毒干擾載體及其對照載體轉(zhuǎn)染進HCT116 及SW620 細胞，48 h 后利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，再使用1 μg∕mL 的嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定傳染細胞株。利用Western blot法檢測細胞AIFM3 蛋白的敲低效率。實驗分為干擾組和陰性對照組兩組，干擾組：轉(zhuǎn)染沉默AIFM3的慢病毒的HCT116∕SW620 細胞；陰性對照組：轉(zhuǎn)染對照載體的HCT116∕SW620 細胞。

1.2.2 免疫組化實驗 按照免疫組化步驟，分別將腫瘤組織及癌旁對照孵育相應(yīng)抗體，并以DAB顯色。選取5 個高倍視野進行結(jié)果評估，分別計數(shù)細胞的著色強弱（無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分）及陽性細胞百分率為陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例（1 分：0%～25%，2 分：26%～50%，3 分：51%～75%，4 分：＞75%），兩者相乘的結(jié)果為該片評分結(jié)果：0 分為陰性，1～4 分為弱陽性，5～8 分為陽性，9～12 分為強陽性。

1.2.3 qRT-PCR 法檢測細胞中的基因表達 取對數(shù)生長期細胞進行胰酶消化，離心后收集細胞，用TRIzol 從結(jié)直腸癌細胞系中提取總RNA，cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Nanodrop 2000 光譜儀（Thermo Fisher Scientific）測定DNA濃度。qRT-PCR用1 μg cDNA 與SYBR Green 試劑，應(yīng)用Biosystem 7500qPCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems）進行擴增。以GAPDH 為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT方法比較相對表達。

1.2.4 CCK8 法檢測細胞增殖能力 收集細胞，以200 個∕孔的濃度接種到96 孔板，每組5 個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72、96、120 h 后加入100 μL 5 mg∕mL CCK8 溶液，37 ℃孵育2 h 后，檢測450 nm 波長下吸光度（OD）值。

1.2.5 平板克隆法檢測細胞增殖能力 收集細胞，以500 個∕孔的濃度接種到6 孔板，每組3 個復(fù)孔，培養(yǎng)2 周后取出倒掉培養(yǎng)基，利用PBS 清洗3 遍，多聚甲醛固定20 min，1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS再度清洗后置于顯微鏡下觀察，選4 個高倍視野進行細胞計數(shù)，取平均值。

1.2.6 Transwell 法檢測細胞遷移能力 收集細胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋后以50 000 個∕孔接種于Transwell上室，每孔200 μL，下室加入600 μL DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h 后取出上室，甲醇固定20 min，擦掉上室殘余細胞，1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS 清洗后置于顯微鏡下觀察，選取4 個高倍視野進行細胞計數(shù)，取平均值。

1.2.7 Gene set enrichment analysis（GSEA）通路富集分析 從通路數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站MsigDB（https：∕∕www.gsea-msigdb.org∕gsea∕msigdb∕）下 載7.0 版 的HALLMARK 注釋基 因 集，并 將TCGA 中的567 份結(jié)直腸癌樣品的按AIFM3 的中位表達量分為高表達組和低表達組，利用R 包“clusterProfiler”進行GSEA 分析［12］。富集結(jié)果篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05 和假陽性率FDR ＜0.25。

1.2.8 Western blot 法檢測細胞相關(guān)蛋白表達情況 收集細胞提取蛋白，測定蛋白濃度，在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）上分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在4 ℃過夜孵育一抗，次日于室溫下孵育1 h 二抗，進行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GarphPad Prism8.0 和R 語言進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；免疫組化結(jié)果和測序數(shù)據(jù)組間比較采取wliconx 秩和檢驗；采用Kapalan-Meier 曲線和Log-rank 檢驗方法比較AIFM3 高表達組和低表達組的生存差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AIFM3 在結(jié)直腸癌中的差異表達 為了研究AIFM3 在結(jié)直腸癌中的表達情況，分析四個結(jié)直腸癌的測序數(shù)據(jù)集：TCGA、GSE117606、GSE100179、GSE71187，比較數(shù)據(jù)集提供的腫瘤組織和癌旁組織的RNA 測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中AIFM3 表達量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1A）。同時利用在南方醫(yī)院病理科保存的17 對配對的腫瘤組織和癌旁組織，進行免疫組化染色并且評分，發(fā)現(xiàn)AIFM3 在癌旁組織的表達量明顯高于腫瘤組織（P＜0.05，圖1B）。分析AIFM3 表達量與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：無論是總生存率OS 還是無病生存率DFS，AIFM3 高表達組都顯著高于低表達組（P＜0.05，圖2）。

圖1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中AIFM3 的差異表達Fig.1 Differential expression of AIFM3 in colorectal cancer and adjacent tissues

圖2 AIFM3 的表達量與結(jié)直腸癌患者預(yù)后情況的聯(lián)系Fig.2 Relationship between the expression of AIFM3 and the prognosis of patients with colorectal cancer

2.2 AIFM3 基因表達沉默的HCT116/SW620 細胞系的鑒定 提取8 種結(jié)腸癌細胞系的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR，選擇表達量最高的細胞系SW620 和另一株表達量處于中間水平的HCT116進行后續(xù)的功能實驗（圖3A）。建立穩(wěn)定干擾AIFM3 表達的細胞株HCT116∕SW620 后，采用qRTPCR 方法和Western blot 方法進行鑒定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組載體后，HCT116∕SW620 細胞中AIFM3 的蛋白表達水平明顯低于HCT116∕SW620-NC 細胞（圖3B、3C），說明AIFM3 基因表達沉默的HCT116∕SW620 細胞系構(gòu)建成功。

圖3 AIFM3 基因表達沉默細胞系的構(gòu)建Fig.3 Construction of AIFM3 gene expression silencing cell line

2.3 CCK8 法結(jié)果分析 從第2 天起，敲低AIFM3后，HCT116 細胞和SW620 細胞增殖速度顯著增加，從第4 天開始，兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4A）。

2.4 細胞遷移實驗結(jié)果分析 Transwell 遷移實驗也表明隨著AIFM3 的表達降低，其遷移能力明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4B）。

2.5 平板克隆結(jié)果分析 敲低AIFM3 后，HCT116細胞和SW620 細胞形成克隆團的數(shù)量顯著增多（P＜0.05，圖4C）。

圖4 AIFM3 的敲低促進了結(jié)直腸癌細胞的增殖與遷移Fig.4 Knockdown of AIFM3 promotes the proliferation and migration of colorectal cancer cells

2.6 通路富集結(jié)果分析 經(jīng)過對GSEA 的富集結(jié)果進行篩選，發(fā)現(xiàn)與AIFM3 關(guān)系密切的信號通路有10 條，包括血管生成、移植排斥反應(yīng)、干擾素反應(yīng)、STAT3 信號通路等（圖5A）?；诂F(xiàn)有文獻，JAK∕STAT3 信號通路的激活與結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移等行為關(guān)系密切［13］。且STAT3 蛋白本身存在于細胞線粒體內(nèi)，參與調(diào)控電子傳遞鏈的活性，影響著線粒體呼吸和細胞代謝過程［14-15］。GSEA 分析結(jié)果還顯示IL6∕JAK∕STAT3 信號通路基因集富集于AIFM3 低表達組（圖5B）。相關(guān)性分析則提示AIFM3 與STAT3 信號通路中的關(guān)鍵分子STAT3 的RNA 表達量呈負相關(guān)（r=-0.15，P＜0.001，圖5C）。

2.7 Western blot 實驗結(jié)果分析 Western blot 結(jié)果顯示敲低在腫瘤細胞中敲低AIFM3 后，STAT3信號通路中的關(guān)鍵分子STAT3 蛋白以及磷酸化狀態(tài)的STAT3 蛋白的表達顯著增加，提示該通路被激活（圖5D）。而STAT3 上游蛋白JAK1，JAK2 蛋白的表達則無顯著變化。

圖5 敲低AIFM3 激活了STAT3 信號通路Fig.5 Knocking down AIFM3 activates the STAT3 signaling pathway

3 討論

結(jié)直腸癌（CRC）是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。而且近年來，中國的CRC 發(fā)病率的持續(xù)上升，發(fā)病人群也趨向于年輕化［2］。其中，CRC 的轉(zhuǎn)移依然是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，而腫瘤轉(zhuǎn)移是一個步驟繁多的復(fù)雜過程，其中局部遷移是腫瘤細胞進入血液循環(huán)的前提。目前，CRC 的遷移機制尚未明確，現(xiàn)有的抗轉(zhuǎn)移治療主要針對已形成轉(zhuǎn)移的病灶，但對于如何預(yù)防腫瘤的早期遷移與播散尚無有效策略。因此，深入了解CRC 的增殖、遷移侵襲等關(guān)鍵步驟的分子機制，可為CRC 的轉(zhuǎn)移提供更有效的防治策略。

線粒體蛋白在多種癌癥的致癌作用中起著關(guān)鍵作用，其表達水平與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8-9，16］。AIFM 蛋白家族是一種線粒體內(nèi)部的氧化還原酶，參與線粒體內(nèi)呼吸鏈的組裝以及調(diào)控細胞的生長與凋亡［17］。該蛋白家族包括了三個蛋白結(jié)構(gòu)相似的成員AIFM1、AIFM2 和AIFM3，其在腫瘤相關(guān)研究中也屢有報道。AIFM1 在肝癌與宮頸癌中能通過誘導(dǎo)凋亡抑制腫瘤細胞生長［18］。AIFM2 則在肺癌中參與了化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡過程［19］，而且近年來被報道參與了多種腫瘤的鐵死亡過程［20-21］。目前關(guān)于AIFM3 在腫瘤中的研究較少。有研究表明AIFM3 在肝癌中作為miR-210 的直接靶點，參與肝癌細胞的細胞周期調(diào)控。在缺氧環(huán)境中，miR-210 通過下調(diào)AIFM3 來抑制肝癌細胞的凋亡［11］。此外也有研究表明AIFM3 與乳腺癌、膽管癌的進展相關(guān)［22-23］，但缺乏細胞實驗的驗證以及機制上的探索。而迄今為止，關(guān)于AIFM3在結(jié)直腸癌中的作用鮮有報道。因此，探索AIFM3的作用和機制對于全面了解結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展的過程具有重要意義。

本研究通過生物信息學(xué)和臨床樣品的免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)AIFM3 在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯低于鄰近正常組織。通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式在兩種人源性結(jié)直腸癌的細胞株中敲低目的蛋白AIFM3，探索其對細胞功能的影響，結(jié)果表明AIFM3 的敲低顯著增強了結(jié)直腸癌細胞的增殖與遷移能力。在機制上，通過GSEA 算法以及MisgDb數(shù)據(jù)庫中提供的HALLMARK 通路相關(guān)基因集分析，發(fā)現(xiàn)AIFM3 與STAT3 信號通路關(guān)聯(lián)密切。STAT3 信號通路是一條在腫瘤生長過程中發(fā)揮重要作用的經(jīng)典信號通路，介導(dǎo)著腫瘤的增殖、侵襲、分化、遷移等過程［13］，與本研究細胞表型實驗結(jié)果相符合。STAT3 蛋白通常被認為穿梭于細胞質(zhì)與細胞核之間，作為轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)相關(guān)核基因表達。但也有研究表明STAT3 蛋白廣泛存在于線粒體膜間隙、內(nèi)膜和基質(zhì)中，與AIFM3 定位重合，參與調(diào)控氧化還原呼吸過程中的電子鏈傳遞（ETC），發(fā)揮著細胞呼吸調(diào)節(jié)劑的作用［14-15］。因此，筆者認為AIFM3 在結(jié)直腸癌細胞中的作用與STAT3 信號通路存在關(guān)聯(lián)。相關(guān)性分析則提示AIFM3 的RNA 表達量與STAT3 呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系。而進一步的WB 實驗驗證了AIFM3 的敲低會上調(diào)STAT3 與磷酸化狀態(tài)的STAT3 的蛋白表達量，證明AIFM3 在結(jié)直腸癌細胞株中被敲低以后，通過激活STAT3 信號通路，促進了結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移。而STAT3 的兩個經(jīng)典上游分子JAK1和JAK2 的蛋白表達量則未觀察到明顯變化，筆者猜測它們與AIFM3 和STAT3 在線粒體內(nèi)的作用無直接關(guān)聯(lián)。

與癌旁組織相比，AIFM3 在結(jié)直腸癌組織中被顯著下調(diào)，其下調(diào)可能是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。本研究還利用TCGA 以及來自于GEO 數(shù)據(jù)庫的三個不同的結(jié)直腸癌臨床數(shù)據(jù)集探索了AIFM3 表達量與預(yù)后的關(guān)系。這四個數(shù)據(jù)集的結(jié)果一致表明，AIFM3 表達量較高的患者擁有更為良好的總生存率（OS）與無病生存率（DFS），提示AIFM3 作為預(yù)后標(biāo)志物的潛在價值。

綜上所述，本研究探索了AIFM3 在結(jié)直腸癌中的作用與機制，證實了AIFM3 在結(jié)直腸癌中表達下調(diào)，而細胞功能實驗提示敲低AIFM3 可通過激活STAT3 信號通路進而促進腫瘤細胞的增殖與遷移。此外，AIFM3 的表達與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果表明AIFM3 有望成為結(jié)直腸癌的分子治療靶點，以及可作為判斷患者預(yù)后情況的指標(biāo)。