許玉玲 王海霞 李金月 夏向群 黃學(xué)勇

河南省疾病預(yù)防控制中心，傳染病預(yù)防控制所，河南省傳染病病原生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（鄭州 450016）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）（簡稱新冠肺炎）是近兩年全球大流行的一種呼吸道傳染病，患者多出現(xiàn)肺部感染癥狀［1］，給全球經(jīng)濟(jì)造成巨大損失?！缎滦凸跔畈《痉揽胤桨浮罚ǖ诎税妫┨岢觥巴夥垒斎搿?nèi)防反彈”的防控策略，落實(shí)“早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早隔離、早治療”的措施，嚴(yán)格落實(shí)“動態(tài)清零”政策。當(dāng)前新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室確診方法主要為核酸檢測實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 法，需要專業(yè)實(shí)驗(yàn)室、人員和儀器，樣本采集后經(jīng)前處理、提取核酸，PCR 體系配制、PCR 擴(kuò)增至獲得結(jié)果，最短需6 h。抗原檢測膠體金法檢測的是樣本中新型冠狀病毒的一種蛋白，方便快捷，不受實(shí)驗(yàn)條件和儀器限制，采樣后10 min 內(nèi)出結(jié)果。本研究選擇河南省疾病預(yù)防控制中心生物資源庫保存的新冠樣本，用實(shí)時(shí)熒光和膠體金兩種方法檢測，對比結(jié)果，分析膠體金法能否作為早期快速診斷新冠感染的一種方法。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 所有標(biāo)本來自河南省新冠肺炎監(jiān)測系統(tǒng)，各省轄市疾控冷鏈運(yùn)輸至河南省疾病預(yù)防控制中心生物資源庫，-80 ℃集中保藏。選擇2021年7-8月份新冠陽性鼻咽拭子60份，口咽拭子30 份；同期，中高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)新冠陰性鼻咽拭子60 份，口咽拭子30 份。

1.2 梯度稀釋和RNA 提取 所有原始樣本按照《新型冠狀病毒防控方案》（第八版）》附件10《新冠病毒樣本采集和檢測技術(shù)指南》進(jìn)行前處理后，在1.5 mL EP管中取原樣本50 μL，加450 μL的病毒保存液進(jìn)行10 倍稀釋，混勻后取50 μL，加入450 μL的病毒保存液進(jìn)行100 倍稀釋。原樣本、10 倍和100 倍稀釋后的樣本，使用QIAGEN 核酸提取試劑盒提取核酸。

1.3 RT-PCR 核酸檢測 使用武漢明德新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）檢測ORF1ab∕N 基因，試劑批號：210804，有效期至2022年6月3日。配制反應(yīng)體系：反應(yīng)液20 μL，RNA 5 μL，設(shè)陰性、陽性對照，使用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，反應(yīng)條件：50 ℃15 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃30 s，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃3 s，60 ℃40 s，40 個(gè)循環(huán)收集熒光信號。陰性、陽性對照結(jié)果正常，Ct值≤38，結(jié)果判陽性。

1.4 膠體金法抗原檢測 使用南京諾唯贊公司的新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測試劑盒檢測，試劑批號V20210506570，有效期至2023年2月17日。將樣本80 μL 加入保存液，混勻后加4 滴入檢測孔，15 min 內(nèi)觀察質(zhì)控線和檢測線，質(zhì)控線測出實(shí)驗(yàn)成立，觀察記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Excel 和SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用（）表示，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示。以核酸檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算180 個(gè)樣本膠體金法抗原檢測的陽性和陰性符合率，計(jì)算13 個(gè)陽性樣本10 倍和100 倍稀釋后，膠體金法抗原檢測的陽性符合率。分別對核酸檢測目標(biāo)基因Ct 值＜25 和25 ＜Ct 值＜30 的樣本進(jìn)行分層統(tǒng)計(jì)，按照公式分別計(jì)算陽性符合率：A∕（A+C）×100%，陰性符合率：D∕（B+D）×100%以及總符合率：（A+D）∕（A+B+C+D）×100%。對膠體金法與核酸檢測結(jié)果進(jìn)行Kappa 分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 法核酸檢測結(jié)果 從大疫情網(wǎng)獲得所有樣本均采自發(fā)病7 d 內(nèi)，新冠陽性樣本90 份，核酸檢測目標(biāo)基因Ct 值均小于35，新冠陰性樣本檢測結(jié)果均陰性。陽性樣本核酸檢測Ct 值結(jié)果見表1。

表1 新冠樣本Ct 值結(jié)果分布Tab.1 Distribution of Ct values of SARS-CoV-2 samples±s

表1 新冠樣本Ct 值結(jié)果分布Tab.1 Distribution of Ct values of SARS-CoV-2 samples±s

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2.2 膠體金法抗原檢測結(jié)果 核酸檢測的陽性樣本90 個(gè)，膠體金法抗原檢測只有1 例為陰性，核酸檢測陰性樣本90 個(gè)，金標(biāo)法抗原檢測結(jié)果均陰性，見表2。

表2 膠體金標(biāo)法檢測結(jié)果Tab.2 Results of colloidal gold method 例

2.3 膠體金法抗原檢測與RT-PCR 法核酸檢測結(jié)果符合率 以核酸檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，膠體金法抗原檢測的陽性符合率為98.89%，95%CI：93.97%～99.80%，陰性符合率為100.00%，95%CI：95.91%～100%，總符合率99.44%，95%CI：96.92%～99.90%。對核酸檢測目標(biāo)基因Ct 值＜25，25＜Ct 值＜30 的樣本進(jìn)行分層統(tǒng)計(jì)，膠體金法抗原檢測的陽性一致率分別為98.44%，95%CI：91.67%～99.72%；98.81%，95%CI：93.56%～99.79%。

2.4 Kappa 分析 Kappa=0.989，膠體金法抗原檢測結(jié)果與RT-PCR 法核酸檢測結(jié)果幾乎完全一致，一致性好。結(jié)果見表3。

表3 抗原檢測膠體金法與RT-PCR 法核酸檢測結(jié)果的Kappa 分析Tab.3 Kappa analysis of colloidal gold method for SARS-CoV-2 and RT-PCR

2.5 梯度稀釋后實(shí)驗(yàn)結(jié)果 13個(gè)原樣本及其10倍和100 倍稀釋后核酸檢測ORF1ab 和N 基因分別為：（22.99 ± 3.83）、（22.49 ± 3.96）；（25.74 ± 4.32）、（25.94±4.88）；（28.66±4.16）、（28.85±4.32）。10倍稀釋后金標(biāo)法檢測結(jié)果均陽性，100 稀釋后金標(biāo)法有2 個(gè)陰性，Ct 值均大于33。10 倍和100 倍稀釋后金標(biāo)法陽性符合率分別為100%、84.61%。

3 討論

《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第八版）》，新型冠狀病毒肺炎確診病例需滿足新冠疑似病例與核酸檢測陽性，或者病毒基因測序與已知新冠病毒高度同源，或未接種過新冠疫苗但新冠特異性IgM 抗體和IgG 抗體陽性等［2］。核酸檢測的是新冠病毒的遺傳物質(zhì)RNA，如果檢測結(jié)果為陽性，可直接確診為感染病例，檢測靈敏度和特異性都高于其他方法。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 是核酸檢測最常用的方法，是確診新冠肺炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”［3］。但PCR 方法也有一些缺點(diǎn)，從前期樣本處理到出報(bào)告通常需要至少4 ～6 h，且存在一定的假陰性；采樣不當(dāng)、標(biāo)本保存不當(dāng)、采用不同類型的標(biāo)本、采樣遇不排毒時(shí)期以及使用不同廠家試劑都可能造成核酸檢測結(jié)果“假陰性”而出現(xiàn)漏診。

病毒基因測序要求專業(yè)儀器、專業(yè)人員、測序?qū)Ｓ迷噭┖?，新型冠狀病毒基因組全長近30 000 bp，二代測序至少需要48 h 出結(jié)果，結(jié)果分析更需要專業(yè)人員操作。但病毒測序有一錘定音的作用，配合流行病學(xué)調(diào)查常作為聚集性疫情病毒溯源的終結(jié)手段，適用于科研及專業(yè)機(jī)構(gòu)。

抗體檢測的是患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)應(yīng)對新冠病毒感染而產(chǎn)生的抗體，新冠患者血清特異性IgM和IgG 抗體在發(fā)病1 周內(nèi)都非常低，隨著病程發(fā)展，IgM 逐漸升高，在第3 周達(dá)到峰值，然后逐漸下降；IgG 抗體在發(fā)病后3～6 周上升幅度較大，發(fā)病后第9 周達(dá)到峰值，并維持一定時(shí)間［4］。健康人群全程接種新冠疫苗后，體內(nèi)特異性IgG 抗體也能維持較長時(shí)間。開展全員核酸檢測是為發(fā)現(xiàn)更多潛在的早期病例，在早期大規(guī)模篩查方法中，血清學(xué)試驗(yàn)并不適用，在臨床上血清學(xué)檢測結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和基礎(chǔ)疾病等情況動態(tài)觀察新冠患者的病程［4］，綜合判斷。

抗原檢測膠體金法是檢測樣本的新型冠狀病毒的一種蛋白，采用雙抗體夾心法，以固相免疫層析形式進(jìn)行測定，待檢樣本的抗原與標(biāo)記物墊上的抗體結(jié)合為膠體金標(biāo)記抗體-抗原的復(fù)合物，繼續(xù)擴(kuò)散至T 線（檢測線）和C 線（質(zhì)控線），指示反應(yīng)完成。如果檢測陽性，很可能為新冠感染病例。張賽等［6］研究顯示該方法檢測新冠病毒抗原靈敏度和特異度都高于96.5%，且與其他呼吸道病原沒有交叉反應(yīng)，可作為現(xiàn)有核酸檢測法的補(bǔ)充手段，用作早期篩查。泰國的研究者CHAIMAYO 等［7］對454 份（60 個(gè)陽性，394 個(gè)陰性）新冠樣本進(jìn)行金標(biāo)法抗原檢測與PCR 檢測對比，金標(biāo)法的靈敏度和特異度為98.33%、98.73%，他們認(rèn)為這種快速簡單的抗原檢測金標(biāo)法可以用作篩查試驗(yàn)。EJAZI 等［8-9］對當(dāng)前各種新冠診斷方法進(jìn)行綜述，認(rèn)為核酸檢測試劑價(jià)格高、檢測時(shí)間長限制了它在大規(guī)模測試中的應(yīng)用，免疫方法簡單且適合大規(guī)模檢測。國外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)對比新冠抗原快速檢測方法和RT-PCR 檢測結(jié)果，認(rèn)為快速檢測抗原的方法可以作為RT-PCR 核酸檢測的輔助方法［10-12］。本研究180 個(gè)樣本，核酸檢測新冠陽性90 個(gè)、新冠陰性90 個(gè)。用膠體金法檢測抗原，與核酸檢測結(jié)果比較，膠體金法陽性符合率98.89%，陰性符合率100%。膠體金法抗原檢測與RT-PCR法核酸檢測方法的一致性統(tǒng)計(jì)指標(biāo)Kappa 值為0.989，一致性非常好。本次研究的新冠陽性樣本核酸檢測ORF1ab 和N 基因Ct 值為23.00 ± 4.38、21.14 ± 4.20，標(biāo)本中病毒載量較高，抗原易檢出。在金標(biāo)法未檢出的一例鼻咽拭子，分析未檢出原因可能與樣本曾進(jìn)行56 ℃30 min 滅活，導(dǎo)致蛋白變性所致。挑選13 個(gè)樣本進(jìn)行10 倍和100 倍的稀釋，每稀釋10 倍，核酸檢測靶基因的Ct 數(shù)值增加3.24 左右，當(dāng)Ct 值大于33 時(shí)，金標(biāo)法檢測的靈敏度下降，100 倍稀釋后金標(biāo)法靈敏度下降，為84.61%。新冠患者早期感染，咽部排毒量較多，PCR 檢測Ct 值較小，膠體金法也更容易檢出，患者感染后期和復(fù)陽階段［13］，咽部排毒量逐漸減少，PCR 檢測Ct值逐漸增加，Ct 值大于33 后，膠體金法檢測容易出現(xiàn)漏檢。

抗原檢測膠體金法具有較高的敏感度和特異度，該方法快速、簡單，準(zhǔn)確并且不受場地、儀器、人員限制，可以作為聚集性疫情需要大規(guī)模排查時(shí)的初篩方法，更早發(fā)現(xiàn)新冠感染者，使“早發(fā)現(xiàn)”關(guān)口前移，提供更多的時(shí)間進(jìn)行摸排、流調(diào)及后續(xù)一系列防控措施的制定，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可以作為早期輔助診斷新型冠狀病毒感染的快速方法。