黃巍 張慶祥 羅丹 馮彰鳳

桂林市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（廣西桂林 541002）

膿毒癥腦?。╯epsis encephalopathy，SE）是膿毒癥一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，患者表現(xiàn)出不同程度的認知功能障礙［1-2］。目前認為，SE 引起的認知障礙與海馬神經(jīng)發(fā)生功能障礙有關(guān)［3］。腦神經(jīng)發(fā)生功能障礙已被證明受長非編碼RNA（lncRNA）的調(diào)控［4］。因此，基于lncRNA 的治療可能對SE 誘導(dǎo)的神經(jīng)變性有效。lncRNA MAGI2-AS3 已被確定為多種疾病中細胞活力的調(diào)節(jié)劑［5］。最近研究報道了MAGI2-AS3 過表達通過下調(diào)miR-374b-5p 可以增強Aβ25-35 對神經(jīng)元活力和神經(jīng)炎癥的影響，并且MAGI2-AS3 敲低可以減輕神經(jīng)毒性和神經(jīng)炎癥［6］。這些結(jié)果提示MAGI2-AS3 與miR-374b-5p相互作用可能參與神經(jīng)疾病進展。因此，本研究將探究MAGI2-AS3 與miR-374b-5p 是否參與小鼠模型中膿毒癥誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡和認知功能障礙，并進一步分析敲低MAGI2-AS3 和上調(diào)miR-374b-5p 是否可以改善這些膿毒癥誘導(dǎo)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物來源和分組 將成年雄性C57BL∕6 J小鼠（6 ～8 周齡，25～31 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司）。實驗中僅使用雄性小鼠，以盡量減少因腦病病理學(xué)的性別差異而導(dǎo)致的異質(zhì)性。將小鼠隨機分為6 組：假手術(shù)組（sham）、CLP 組、CLP+si-NC 組，CLP+si-MAGI2-AS3、CLP+NC mimic和CLP+miR-374b-5p，每組15只。CLP組：使用盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）手術(shù)建立小鼠膿毒癥模型；CLP+si-MAGI2-AS3 組：在CLP 術(shù)之前3 d 注射針對MAGI2-AS3 的短干擾RNA；CLP+miR-374b-5p 組：CLP 術(shù)前3 d 注射miR-374b-5p 模擬物；CLP+si-NC 組：CLP 術(shù)前3 d 注射亂序?qū)φ誷iRNA；CLP+NC mimic 組：CLP 術(shù)前3 d注射模擬物對照。在CLP 手術(shù)后，小鼠從第8 天開始進行5 d 的Morris 水迷宮試驗，并在第13 天進行恐懼條件反射測試。然后處死小鼠，取出海馬組織。

1.2 CLP模型建立 使用腹膜內(nèi)氯胺酮（80 mg∕kg）和甲苯噻嗪（5 mg∕kg）麻醉動物。消毒后，在劍突下方縱向做一個2 ～3 cm 的切口以暴露腹腔［7］。分離盲腸并在極遠端與盲腸基部之間距離的一半處結(jié)扎，用22 號針頭穿刺兩次。將糞便內(nèi)容物輕輕擠壓到腹腔中。然后，將盲腸小心地放回腹腔，并縫合腹部。對于假手術(shù)組的動物，打開腹腔以暴露盲腸，無需結(jié)扎或穿孔。手術(shù)后，腹腔內(nèi)給予1 mL 預(yù)熱至37 ℃的無菌生理鹽水進行補液。

1.3 基因敲低和過表達 MAGI2-AS3 敲低和miR-374b-5p 過表達使用具有以下序列的siRNA 敲低MAGI2-AS3：5'-CAGCAGAGAAATGATATCTAGACCA-3'（si-MAGI2-AS3）和亂序?qū)φ招蛄校?'-GACCGATAACGAAAGCACAAATTGT-3'（si-NC）。siRNA、miR-374b-5p mimic（miR-374b-5p）和NC 慢病毒載體（NC mimic）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計和合成。使用EntransterTM 體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑（北京英格恩生物有限公司）轉(zhuǎn)染慢病毒，將2.5 μg 慢病毒溶解在2.5 μL 無RNase 的水中，然后與2.5 μL體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑輕輕混合，并在室溫下保持15 min。CLP小鼠用0.5%戊巴比妥鈉（50 mg∕kg，腹腔注射）麻醉，頭部固定在SR-5 立體定向框架（日本Narishige公司）。硬腦膜暴露后，在無菌條件下用微量注射器（瑞典Dakumar Machinery 公司）將5 μL 混合物注射進腦室內(nèi)。立體坐標(biāo)是左半球前囟的外側(cè)1.0 mm 和后0.5 mm，硬腦膜表面下方2.5 mm。注射后將注射器保持在原位10 min，以盡量減少液體回流。

1.4 Morris 水迷宮測試 由對分組不知情的研究人員進行標(biāo)準(zhǔn)的5 d Morris 水迷宮測試。在最初的4 d 小鼠接受空間獲取訓(xùn)練，每天進行4 次，每次間隔為20 min。每次訓(xùn)練的時間為60 s。訓(xùn)練動物通過游泳到原始目標(biāo)象限水面下0.5 cm 處的隱藏平臺上逃脫。未能在60 s 內(nèi)定位平臺的動物被人工引導(dǎo)至平臺。在移出之前，允許小鼠在平臺上停留20 s。使用運動檢測軟件（美國Actimetrics instruments 公司）分析逃逸潛伏期。第5 天，平臺被移除以進行探針測試。在60 s 的測試中，記錄目標(biāo)象限上的交叉次數(shù)和在該象限中花費的總時間。

1.5 恐懼條件反射測試 在Morris 水迷宮實驗完成后的第2 天進行了恐懼條件反射測試。所有小鼠都被放置在一個用70%乙醇擦拭過的帶有不銹鋼條地板的室中。該腔室允許聲音刺激以訓(xùn)練條件反射，以及使用恒流發(fā)生器對腳進行電刺激。允許小鼠在訓(xùn)練環(huán)境中探索和適應(yīng)3 min。然后，采用單頻聲音刺激30 s（1 kHz，80 dB），并在該聲音結(jié)束的最后2 s 期間，傳遞足部電擊（1 mA）。在30 s 的停頓之后，再次應(yīng)用這種聲音刺激和足部電擊的組合。24 h 后，允許小鼠在沒有任何刺激的情況下進入原始室以監(jiān)測不動狀態(tài)行為。2 h后，進行提示恐懼條件反射測試，將動物置于室內(nèi)并在無足部電擊的情況下接受單頻聲音3 min，并監(jiān)測和記錄不動狀態(tài)行為。

1.6 標(biāo)本采集 行為測試后，每組隨機抽取5 只小鼠，用0.4%戊巴比妥鈉麻醉并固定于解剖板上。通過打開胸部暴露心臟，然后將鈍注射器針頭通過右心尖插入左心室，用生理鹽水完全灌注小鼠，并逐滴補充4%多聚甲醛。腦組織在4%多聚甲醛中固定48 h，然后切成2 ～3 mm 的切片，暴露海馬橫截面。在常規(guī)脫水、透化和石蠟包埋后，將組織切成3 μm 的切片，然后附著在預(yù)處理過的載玻片上。另取5 只小鼠頸椎脫臼處死，冰上分離海馬組織，液氮處理后-80 ℃保存用于RT-qPCR和Western blot 分析。

1.7 TUNEL 染色 切片采用TUNEL 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）進行染色。蘇木精復(fù)染，光鏡下TUNEL 陽性細胞核呈棕黃色。計數(shù)TUNEL 陽性細胞以計算凋亡指數(shù)（AI）：AI=陽性細胞數(shù)∕細胞總數(shù)×100%。

1.8 RT-qPCR 分析 用Trizol RNA 提取試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）從各組海馬組織中提取總RNA。MAGI2-AS3、miR-374b-5p 和HOXB7 的引物由美國Invitrogen 公司合成。miR-374b-5p 的內(nèi)參為U6，MAGI2-AS3 和HOXB7 的內(nèi)參為3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司）獲得互補DNA。采用實時熒光定量PCR 試劑盒（Takara）進行熒光定量PCR 分析。使用2-ΔΔCT方法將目標(biāo)基因的相對表達水平歸一化為U6 和GAPDH 的相對表達水平。引物序列如下：MAGI2-AS3：Forward：5'-CAAGAAACAGCAACACCAGAAG-3'，Reverse：5'-TAAGGTCCCCATTCAAGTCAGT-3'；miR-374b-5p：Forward：5'-TCGAATCTAGAGATCCGACGCCGC-3'，Reverse：5'-GACGTGTAAACATCCTACACTCAGCT-3'；HOXB7：Forward：5'-TTCATTCCTACCCTCTACCACTTTC-3'，Reverse：5'-TTAACATGGCATCTTCGACACTCT-3'；GAPDH：Forward：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCATCA-3'，Reverse：5'-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3'；U6：Forward：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'；Reverse：5'-TGATGGCATGGACTGTGGTC-3'。

1.9 Western blot 分析 按照蛋白提取試劑盒（Takara）說明書提取各組海馬組織總蛋白，蛋白含量用二辛可寧酸試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）測定。蛋白質(zhì)通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，并在含有5%脫脂牛奶的吐溫20 的Tris 緩沖鹽水中封閉1 h。隨后，將膜與針對HOXB7（1∶1 000）、B 細胞淋巴瘤相關(guān)X（Bax）（1∶500）、Cleaved caspase-3（1∶500）（均購自英國Abcam 公司）和β-肌動蛋白（1∶500，美國Cell Signaling Technology 公司）的一抗一起孵育過夜，然后用相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000，Cell Signaling Technology）孵育2 h。在暗處加入增強化學(xué)發(fā)光溶液進行顯色。以βactin 為內(nèi)參，用Cel-Pro-Analyzer 分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.10 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 分離新生C57BL∕6 J小鼠海馬神經(jīng)元（24 h 內(nèi)出生，雄性，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司）。通過頸椎脫位對小鼠進行安樂死，去除頭部和腦組織上的頭骨和皮膚后，取出海馬組織并置于預(yù)冷的Dulbecco's 改良Eagle培養(yǎng)基中。用木瓜蛋白酶（美國Sigma-Aldrich公司）切割和分離組織。然后將神經(jīng)元以6 × 105個細胞接種在聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿（35 mm）中，并在含有1% B27（5% CO2、37℃）孵育7 d，每3 天更換一半培養(yǎng)基。細胞分組：空白對照組（未進行任何處理的細胞）；LPS 組（僅用1 μg∕mL LPS 處理細胞24 h）；LPS+si-NC 組（用LPS 處理si-NC 轉(zhuǎn)染的細胞24 h）；LPS+si-MAGI2-AS3 組（用LPS 處理si-MAGI2-AS3 轉(zhuǎn)染的細胞24 h）；LPS+NC mimic 組（用LPS 處理NC mimic 轉(zhuǎn)染的細胞24 h）；LPS+miR-374b-5p 組（用LPS 處理miR-374b-5p 轉(zhuǎn)染的細胞24 h）。轉(zhuǎn)染前48 h，將細胞以3×105個細胞∕mL的密度接種在6 孔板中，并通過Lipofectamine 2000試劑（美國Thermo Fisher 公司）轉(zhuǎn)染慢病毒。

1.11 MTT 測定和流式細胞術(shù) 細胞用LPS 處理24 h，用細胞生長液懸浮將細胞濃度調(diào)整為1×105個細胞∕mL。將細胞接種到96 孔板中培養(yǎng)48 h（37 ℃，5%CO2），并在最后4 h加入5 mg∕mL MTT 溶液。通過酶標(biāo)儀檢測光密度（OD）值。

細胞用LPS 處理24 h，將細胞用200 μL 結(jié)合緩沖液懸浮，與5 μL 碘化丙啶和5 μL Annexin-V在黑暗中均勻混合15 min。流式細胞儀觀察細胞凋亡情況，計算各組細胞凋亡率。

1.12 雙熒光素酶報告基因檢測 使用生物信息學(xué)軟件DIANA-LncBase v2、Targetscan、miRanda 預(yù)測MAGI2-AS3 和miR-374b-5p 以及miR-374b-5p 和HOXB7 的結(jié)合位點。構(gòu)建含有miR-374b-5p 結(jié)合位點的野生型MAGI2-AS3 報告基因（wt-MAGI2-AS3）和HOXB7 報告基因（wt-HOXB7），以及不含結(jié)合位點的突變型MAGI2-AS3 報告基因（mut-MAGI2-AS3）和HOXB7 報告基因（mut-HOXB7）。將上述報告基因與miR-374b-5p 模擬物或NC mimic 共轉(zhuǎn)染到海馬神經(jīng)元中。待細胞生長至一定融合度裂解后，用熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega 公司）檢測熒光素酶活性。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)。細胞實驗一式三份，測量數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，多組比較行方差分析，使用Tukey 的多重比較檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CLP 小鼠認知障礙評估及MAGI2-AS3、miR-374b-5p 的變化 在Morris 水迷宮中，所有組小鼠的逃避潛伏期在4 d 訓(xùn)練中逐漸降低（圖1A）。在第2 ～4 天期間，CLP 組比假手術(shù)組有更長的逃避潛伏期（P＜0.05）。CLP 組在目標(biāo)象限中花費的時間比假手術(shù)組更短，并且在目標(biāo)象限中交叉次數(shù)更少（P＜0.05，表1）。在情境式恐懼條件反射測試中，CLP 小鼠的不動狀態(tài)持續(xù)時間比假手術(shù)組小鼠短（P＜0.05），而兩組在對提示作出反應(yīng)的不動狀態(tài)持續(xù)時間相似（表1）。在CLP 手術(shù)后第3、7 和14 d，與假手術(shù)組相比，CLP 小鼠海馬組織中MAGI2-AS3 表達逐漸增加（P＜0.05），而miR-374b-5p 表達逐漸降低（P＜0.05，圖1B、C）。

圖1 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 過表達提高CLP 小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力Fig.1 MAGI2-AS3 silencing or miR-374b-5p overexpression enhanced spatial learning and memory in CLP mice

表1 小鼠行為測試Tab.1 Behavioral tests of mice ±s

表1 小鼠行為測試Tab.1 Behavioral tests of mice ±s

注：與Sham 組相比，*P＜0.05，***P＜0.001；與CLP 組相比，#P＜0.05

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2.2 MAGI2-AS3沉默或miR-374b-5p過表達提高CLP 小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力 在Morris水迷宮中，轉(zhuǎn)染了si-MAGI2-AS3 或miR-374b-5p 的CLP 小鼠在第2 ～4 天的逃逸潛伏期比CLP 組小鼠縮短（圖1A），并延長了在目標(biāo)象限中的時間使交叉次數(shù)增加（P＜0.05，圖1B、C）。在情境恐懼條件反射測試中，所有CLP小鼠的不動狀態(tài)持續(xù)時間均比假手術(shù)組小鼠短，并且轉(zhuǎn)染了si-MAGI2-AS3 或miR-374b-5p 的CLP 小鼠的不動狀態(tài)持續(xù)時間較CLP 組明顯增加（P＜0.05，圖1）。各組在對提示作出反應(yīng)的不動狀態(tài)持續(xù)時間相似（圖1）。

2.3 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 過表達減輕CLP 小鼠海馬神經(jīng)元凋亡 與Sham 組相比，CLP 組TUNEL 陽性神經(jīng)元顯著增加（P＜0.05）。與CLP 組相比，si-MAGI2-AS3 和miR-374b-5p 組中TUNEL 陽性神經(jīng)元顯著減少（P＜0.05，圖2A）。與假手術(shù)組相比，CLP 組海馬組織中Bax 和Cleaved caspase-3 表達增加（均P＜0.05）。與CLP 組相比，si-MAGI2-AS3 和miR-374b-5p 組 的Bax 和Cleaved caspase-3 表達降低（均P＜0.05，圖2B）。

圖2 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 過表達減輕CLP 小鼠海馬神經(jīng)元凋亡Fig.2 MAGI2-AS3 silencing or miR-374b-5p overexpression alleviated hippocampal neuronal apoptosis in CLP mice

2.4 MAGI2-AS3 沉 默 或miR-374b-5p 過 表 達 可增強LPS 處理的海馬神經(jīng)元的活力并抑制其凋亡 LPS 處理后，LPS 組神經(jīng)元增殖抑制率和凋亡率較對照組升高（P＜0.05），并且si-MAGI2-AS3 組和miR-374b-5p 模擬物組神經(jīng)元增殖抑制率和凋亡率較LPS 組降低（P＜0.05），見表2。

表2 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 過表達可增強LPS處理的海馬神經(jīng)元的活力并抑制其凋亡Tab.2 MAGI2-AS3 silencing or miR-374b-5p overexpression enhanced the viability and inhibited apoptosis of LPS-treated hippocampal neurons ±s

表2 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 過表達可增強LPS處理的海馬神經(jīng)元的活力并抑制其凋亡Tab.2 MAGI2-AS3 silencing or miR-374b-5p overexpression enhanced the viability and inhibited apoptosis of LPS-treated hippocampal neurons ±s

注：與空白對照組相比，**P ＜0.01，***P ＜0.001；與LPS 組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

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2.5 MAGI2-AS3 過表達通過miR-374b-5p 上調(diào)HOXB7參與神經(jīng)元損傷 海馬神經(jīng)元與wt-HOXB7和miR-374b-5p 模擬物共轉(zhuǎn)染后，wt-HOXB7 的活性被miR-374b-5p 抑制，細胞相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05，圖3A）。此外，海馬神經(jīng)元與wt-MAGI2-AS3 和miR-374b-5p 模擬物共轉(zhuǎn)染后，wt-MAGI2-AS3 的活性被miR-374b-5p 抑制，細胞的相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05，圖3B）。與假手術(shù)組相比，CLP 組miR-374b-5p 表達明顯下調(diào)（P＜0.05），MAGI2-AS3 和HOXB7 表達顯著增加（P＜0.05）。與CLP組相比，si-MAGI2-AS3組和miR-374b-5p 組的HOXB7 mRNA 和蛋白表達均顯著減少（P＜0.05，圖3C、D）。

圖3 MAGI2-AS3 通過miR-374b-5p 上調(diào)HOXB7 參與神經(jīng)元損傷Fig.3 MAGI2-AS3 participated in neuronal injury by up-regulating HOXB7 via miR-374b-5p

3 討論

臨床中，與非SE 患者相比，SE 患者長期認知功能障礙的發(fā)生率顯著增加，并且SE 患者更容易患神經(jīng)退行性疾?。?-9］。此外，膿毒癥模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量較對照大鼠減少，神經(jīng)元形態(tài)呈現(xiàn)退行性特征［10］。與先前的研究結(jié)果一致，本研究證實了膿毒癥導(dǎo)致認知缺陷，并會導(dǎo)致小鼠海馬組織中TUNEL陽性神經(jīng)元明顯增多。海馬體是大腦中負責(zé)記憶形成的關(guān)鍵區(qū)域［11］。海馬錐體神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)會損害突觸可塑性和記憶［12-13］。因此，筆者推測膿毒癥引起的CLP 小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降可能是由海馬神經(jīng)凋亡引起的。

MAGI2-AS3 主要在大腦的突觸連接處表達［14-15］。最近研究報道了MAGI2-AS3 過表達可以增強Aβ25-35 對神經(jīng)元活力和神經(jīng)炎癥的影響，并且MAGI2-AS3 敲低可以減輕神經(jīng)毒性和神經(jīng)炎癥［6］。此外，還有研究證明MAGI2-AS3調(diào)控Fas∕FasL通路抑制神經(jīng)母細胞瘤生長［16］。本研究中，CLP手術(shù)引起的膿毒癥導(dǎo)致海馬組織中MAGI2-AS3表達增加以及miR-374b-5p 表達降低，抑制MAGI2-AS3∕miR-374b-5p∕HOXB7 信號軸可以保護海馬免受膿毒癥誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)發(fā)生缺陷和神經(jīng)變性。相關(guān)研究表明，MAGI2-AS3 在卵巢癌和肝癌組織和細胞系中升高［5，17］，表明MAGI2-AS3 在人類疾病中的促進作用。有研究表明miR-374b-5p 在肝癌或肺癌細胞和組織中的表達降低［5，18］。這些證據(jù)表明miR-374b-5p 在人類疾病中具有抑制功能。HOXB7 是一種在DNA 合成轉(zhuǎn)錄過程中起關(guān)鍵作用的同源盒基因（HOX）家族中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［19-20］。研究發(fā)現(xiàn)HOXB7 在某些癌癥中過度表達，例如骨肉瘤和肝癌［21-22］，表明HOXB7 在人類疾病中的刺激作用。本研究證實了MAGI2-AS3 沉默和miR-374b-5p 上調(diào)減少了CLP 小鼠海馬組織中HOXB7 mRNA 和蛋白表達。因此，MAGI2-AS3 通過靶向miR-374b-5p 上調(diào)HOXB7 參與CLP 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。

總之，本研究表明MAGI2-AS3 和HOXB7 在CLP 小鼠海馬中上調(diào)，而miR-374b-5p 則下調(diào)，并且MAGI2-AS3 沉默通過上調(diào)miR-374b-5p 和下調(diào)HOXB7 來抑制CLP 小鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。因此，靶向MAGI2-AS3∕miR-374b-5p∕HOXB7 軸可能為治療或預(yù)防SE 的神經(jīng)變性提供治療策略。