聶微 嚴(yán)芝強 成興真 劉麗榮 楊芳，3

1貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院臨床檢驗基礎(chǔ)與血液學(xué)教研室（貴陽550004）；貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2胃腸外科，3臨床檢驗中心（貴陽 550004）

鉑類藥物研發(fā)于20 世紀(jì)60年代，是美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦的胃癌一線基礎(chǔ)化療藥，其中OXA 屬于第三代鉑類抗腫瘤藥物，OXA 進入細胞后可以和細胞質(zhì)中線粒體和細胞核上的DNA 結(jié)合、形成多種交鏈結(jié)構(gòu)，抑制腫瘤細胞DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［1］。鉑類引起的線粒體和細胞核上DNA損傷可以激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、進而激活細胞凋亡信號，當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被異常激活或抑制時，細胞會表現(xiàn)出對鉑類藥物的抵抗及凋亡抑制［2］。OXA 的胃腸道反應(yīng)、腎毒性及血液毒性低于第一、二代鉑類藥，臨床患者通過OXA 聯(lián)合治療后可獲得近50%的緩解率，還可提高患者5年生存率及生存質(zhì)量［3］；但隨著用藥時間的延長，OXA 耐藥嚴(yán)重影響了患者治療效果。為此，如何提高胃癌細胞對OXA 的敏感性、避免化療耐藥性的產(chǎn)生，是目前亟待解決的臨床問題，研究耐藥機制并探索可能的逆轉(zhuǎn)耐藥策略是解決問題的關(guān)鍵，而建立良好的耐藥細胞株模型是進行體外研究腫瘤細胞發(fā)生耐藥機制的前提。

自噬是機體的穩(wěn)態(tài)機制，生理情況下細胞的基礎(chǔ)自噬水平較低，通過細胞內(nèi)溶酶體降解細胞產(chǎn)生的無用成分，包括錯誤折疊的蛋白質(zhì)、毒性聚合物和受損的細胞器等，從而維持細胞的存活，發(fā)揮細胞的質(zhì)檢及自凈作用［4］，當(dāng)自噬過程發(fā)生紊亂，這種自穩(wěn)調(diào)控機制就會失靈，細胞的穩(wěn)態(tài)受到破壞，發(fā)生細胞死亡和組織損傷，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生［5-6］。有研究表明，化療藥物可在腫瘤細胞中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，為細胞適應(yīng)環(huán)境存活而提供條件［7-8］，有證據(jù)表明自噬和耐藥密切相關(guān)［9］，自噬誘導(dǎo)腫瘤細胞耐藥的機制可能有兩種：一方面腫瘤細胞可以利用溶酶體消化降解細胞內(nèi)功能障礙的細胞器、蛋白及各種生物大分子，并通過回收利用，使細胞免于凋亡或死亡，為細胞的生存提供重要保障；另外，自噬是通過某種方式緩解細胞內(nèi)部的壓力，同時降解有害物質(zhì)，使細胞能適應(yīng)新環(huán)境，保證細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及生存［10］。

OXA 是胃癌患者一線基礎(chǔ)化療藥，長期用藥會導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生，其機制與化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞的自噬功能異常有關(guān)。本研究選取人胃癌細胞MGC-803 構(gòu)建OXA 耐藥細胞株MGC-803∕OXA，用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化，檢測細胞耐藥指數(shù)；用流式細胞儀檢測細胞周期分布及凋亡，RT-qPCR 檢測耐藥相關(guān)基因多藥耐藥基因1（mμltidrug resistance gene1，MDR-1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（mμltidrug resisetance-related proteins，MRP）、切除修復(fù)交叉互補基因（excision repair cross complementing 1，ERCC1）的mRNA 表達，Western blot檢測耐藥相關(guān)基因蛋白MDR-1、MRP、ERCC1 及自噬相關(guān)蛋白P62、Beclin-1 和LC3 表達；同時用透射電鏡觀察MGC-803∕OXA 細胞中自噬體數(shù)量及結(jié)構(gòu)變化；探討OXA 治療胃癌時的耐藥機制，為逆轉(zhuǎn)耐藥策略提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及細胞株 人胃癌細胞株MGC-803（Cat.No.TC-hxbz-026，深圳拓普生物技術(shù)有限公司），奧沙利鉑（Oxaliplatin，OXA，恒瑞制藥公司），3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA，上海Selleck公司）。

1.1.2 實驗試劑與儀器 細胞活力檢測試劑盒（CCK8，日本同仁化學(xué)研究所），GAPDH 抗體（武漢三鷹proteintech），MRP、MDR-1、ERCC1、P62、Beclin-1 和LC3 抗體（美國CST），Trizol 試劑、RT Mix、SYBR EX Taq（Takara 公司），RIPA 細胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)公司），蛋白濃度檢測試劑盒（杭州弗德生物科技有限公司），ECL 試劑盒（Millipore），倒置相差顯微鏡（Olympus 公司），羅氏480 PCR 儀（Roche 公司），透射電鏡（日本JEOL）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 所有細胞在37 ℃飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為10%胎牛血清（FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和1%鏈霉素的1640 培養(yǎng)基。

1.2.2 人胃癌耐藥細胞株的誘導(dǎo) 采用OXA 濃度梯度遞增誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MGC-803 細胞獲得耐藥，起始的OXA 濃度為0.1 μg∕mL，加藥孵箱24 ～48 h 后根據(jù)細胞生長狀態(tài)更換無OXA 的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中密切觀察細胞的生長狀態(tài)，合適時進行傳代，重新復(fù)蘇待細胞生長至對數(shù)生長期并生長狀態(tài)良好時再次換成含有OXA 的培養(yǎng)基，并逐漸提高OXA 濃度，視細胞生長狀態(tài)逐步增加OXA 的遞增量，濃度梯度如下：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μg∕mL，前期細胞生長較緩慢，當(dāng)細胞生長接近正常時，逐漸加大OXA 濃度，加至4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg∕mL；增加藥物濃度后，細胞生長開始變慢，當(dāng)濃度加到32.0 μg∕mL 時，開始出現(xiàn)很多死細胞，再連續(xù)培養(yǎng)3 個月，發(fā)現(xiàn)細胞能在4 μg∕mL 的OXA 濃度中穩(wěn)定生長的耐藥細胞株，并用MGC-803∕OXA 表示。用倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，分別取生長狀態(tài)良好的MGC-803∕OXA 及MGC-803 進行下一步實驗。耐藥細胞模型于實驗前1 周撤去含OXA 的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并且傳代穩(wěn)定生長后使用。

1.2.3 CCK-8 法檢測MGC-803/OXA、MGC-803細胞的耐藥性 取計數(shù)好的、混勻的細胞懸液，按照104∕孔接種于96 孔板中，每孔200 μL，5% CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h，室溫?zé)o菌PBS 洗3 次后，加入OXA 處理，去除原含藥物培養(yǎng)基，再次用室溫?zé)o菌PBS 洗3 次后，向96 孔板中加入100 μL 去血清1640 培養(yǎng)基；避光條件下向各孔中加入CCK8試劑10 μL，37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。酶標(biāo)儀上測定各孔在450 nm 處的吸收光值（即OD值），一般的OD值在0.5 ～2.5，若在0.8 ～1.5 時則表示結(jié)果較為準(zhǔn)確。同時設(shè)置1640 對照組、陰性對照組及實驗組。細胞抑制率=（對照孔-實驗孔）∕（對照組-空白組）×100%，根據(jù)計算的細胞抑制率繪制細胞生長曲線。抑制率=［1-實驗組A 值∕對照組A 值均值］×100%，50%抑制濃度（IC50）計算耐藥系數(shù)（RI）=IC50耐藥細胞∕IC50親代細胞。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取出生長至80%的MGC-803∕OXA、MGC-803 細胞，預(yù)冷PBS 1.5 mL洗細胞2 ～3 次收集細胞沉淀，棄上清，用預(yù)冷PBS 1.5 mL 洗滌，去除PBS 和細胞碎片，再加入500 μL 預(yù)冷PBS，邊震蕩邊加入70%酒精，酒精至少3.5 mL，4 ℃固定4 h 以上。固定好的細胞于-20 ℃保存。1 000 r∕min 離心5 min 后去掉乙醇，加入PBS 再次洗滌后去上清，將殘存的乙醇除去，加入PBS 200 μL、RNA 酶2 μL，室溫下30 min消化RNA。加入50 μg∕mL PI 染料0.5 mL，室溫避光30 min，將細胞過濾至含PBS 的離心管中，1 h 內(nèi)用流式細胞儀檢測，一般計數(shù)2 ～3 萬個細胞。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取出長至80%的MGC-803∕OXA、MGC-803 細胞，預(yù)冷PBS 洗細胞2 ～3 次收集細胞沉淀，加入1 mL 預(yù)冷PBS 轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管。每管加入1×Binding Buffer 100 μL混均勻，每管各加FITC 5 μL、PI 5 μL，室溫避光反應(yīng)15 min，1 500 r∕min 離心5 min（4 ℃），在1 h 內(nèi)流式細胞儀檢測，一般計數(shù)2 ～3 萬個細胞。

1.2.6 TRIzol法提取總RNA MGC-803∕OXA、MGC-803 細胞在培養(yǎng)瓶中長滿80%，取1 ～5 × 105個細胞用PBS 洗滌細胞2 次。加入1 mL TRIzol 劇烈震蕩，使用氯仿、異丙醇、75%乙醇提取總RNA，加DEPC 水40～80 μL 溶解，于-80 ℃冰箱保存。在酶標(biāo)儀上測定RNAOD260∕OD280比值，比值在1.8～2.0純度符合要求。驗證合格的RNA 用RT Mix 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.7 Real time PCR檢測mRNA的表達變化 引物序列設(shè)計：GAPDH、MRP、MRP-1、ERCC1 基因引物序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，序列如表1。測定mRNA 的相對表達量時使用GAPDH 作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為20 μL，擴增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析各基因mRNA 的相對表達量。

表1 GAPDH、MRP、MRP-1、ERCC1 基因引物序列Tab.1 GAPDH、MRP、MRP-1、ERCC1 gene primer sequence

1.2.8 Western blot 蛋白印跡分析檢測蛋白水平的變化 6 孔板每孔細胞加80 μL 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30 min 提取總蛋白并使用蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，每孔上樣蛋白總質(zhì)量為30 μg，進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后使用特異性一抗孵育16 h 以上，TBST 緩沖液清洗3 次后使用二抗孵育1 h，使用ECL 發(fā)光試劑盒通過印跡曝光儀進行圖像獲取，再使用image J 分析軟件測定蛋白條帶的積分光密度值，每個樣品同時檢測GAPDH 蛋白條帶作為內(nèi)參。

1.2.9 透射電子顯微鏡（TEM） MGC-803∕OXA、MGC-803 細胞在培養(yǎng)瓶中長滿80%時倒掉培養(yǎng)液，加入電鏡固定液，4 ℃固定2 ～4 h，細胞低速離心至管底可以看到綠豆大小的細胞團塊，1%瓊脂糖包裹，0.1 mol∕L 磷酸緩沖液（pH7.4）漂洗3 次，每次15 min。1%的鋨酸0.1 mol∕L 磷酸緩沖液PB（pH7.4）室溫（20 ℃）固定2 h。0.1 mmol∕L 磷酸緩沖液PB（pH7.4）漂洗3 次。依次加入50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精，100%丙酮，上行脫水。丙酮∶812 包埋劑=1∶1 浸泡2 ～4 h，丙酮∶812 包埋劑=2∶1 滲透過夜，純812 包埋劑5 ～8 h，將純812 包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜。60 ℃烤箱聚合48 h。超薄切片機切片厚60 ～80 nm。鈾鉛雙染色（2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min），切片室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.2.10 用自噬抑制劑3-MA 藥物誘導(dǎo)細胞 細胞密度生長至70%，使用終濃度為5 mol∕L 的3-MA處理24 h，對照組加入同等體積的DMSO 處理相同的時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Graphpad Prism 8.0 作圖，計量資料符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性檢驗方差齊時，單因素分析采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥細胞的誘導(dǎo)和細胞生物學(xué)特性

2.1.1 細胞形態(tài) 倒置相差顯微鏡下可見MGC-803和MGC-803∕OXA 細胞形態(tài)學(xué)特點：MGC-803 細胞貼壁生長、呈上皮樣單層排列、大小較均一、細胞形態(tài)規(guī)則、邊界清晰、核大、圓形或橢圓形；MGC-803∕OXA 耐藥細胞同樣呈上皮樣單層排列，但細胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則、邊界欠清晰、核大、色深、折光性變強、并常呈聚團生長狀態(tài)，細胞增殖緩慢，死亡細胞較多。見圖1。

圖1 MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞的形態(tài)Fig.1 Morphology of MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.1.2 MGC-803 和MGC-803/OXA 的耐藥指數(shù) MGC-803 和MGC-803∕OXA 耐藥指數(shù)測定：OXA 濃度梯度為0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg∕mL，CCK8 法檢測細胞OD值計算細胞抑制率，以藥物濃度為橫軸，細胞抑制率為縱軸，繪制濃度效應(yīng)曲線，求得半數(shù)抑制濃度（IC50），計算MGC-803∕OXA 耐藥指數(shù)為7.04（RI= IC50（耐藥株）∕IC50（親本株）），RI ＞5認為耐藥細胞系的耐藥性符合耐藥株的要求。見圖2。

圖2 MGC-803、MGC-803∕OXA 對OXA 藥物的IC50Fig.2 IC50 diagram of MGC-803 and MGC-803∕OXA to Oxaliplatin

2.1.3 MGC-803 和MGC-803/OXA 的細 胞 周期分布 流式細胞儀檢測細胞周期分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OXA 誘導(dǎo)后MGC-803∕OXA 耐藥細胞株對數(shù)生長期的增殖速度減慢，G0∕G1 期分布增加、S 期分布明顯減少、G2∕M 期分布明顯延長，與MGC-803 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示OXA 可改變耐藥細胞的細胞周期。見圖3。

圖3 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的細胞周期分布Fig.3 Cell cycle distribution of MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.1.4 MGC-803 和MGC-803/OXA 的細胞凋 亡 結(jié)果 流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，OXA 誘導(dǎo)后MGC-803∕OXA 的凋亡明顯減少，與MGC-803比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示OXA 抑制耐藥細胞凋亡。見圖4。

圖4 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的細胞凋亡Fig.4 Apoptosis map of MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.1.5 耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP、ERCC1 mRNA在MGC-803 和MGC-803/OXA 中的表達 RTqPCR 檢測耐藥相關(guān)基因mRNA 表達水平，結(jié)果顯示MGC-803∕OXA 的細胞中MDR-1、MRP、ERCC1 mRNA 表達高于MGC-803（P＜0.01）。見圖5。

圖5 MGC-803、MGC-803∕OXA 細胞耐藥相關(guān)基因mRNA表達Fig.5 mRNA expression of drug resistance related genes in MGC-803 and MGC-803∕OXA cells

2.1.6 耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP、ERCC1蛋白在MGC-803和MGC-803/OXA細胞中表達 Western blot 檢測耐藥相關(guān)基因蛋白表達，結(jié)果顯示MGC-803∕OXA 的細胞中MDR-1、MRP、ERCC1 蛋白表達高于MGC-803（P＜0.05）。見圖6。

圖6 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的細胞中耐藥相關(guān)基因蛋白表達Fig.6 Protein expression of drug resistance-related genes in MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.2 MGC-803 和MGC-803/OXA 細胞中P62、Beclin-1 和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達 Western blot 檢測MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞中P62、Beclin-1 和LC3Ⅱ∕Ⅰ等自噬相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示與親本細胞株MGC-803 相比，MGC-803∕OXA 中P62 蛋白表達下調(diào)，Beclin-1 蛋白的表達和LC3Ⅱ∕Ⅰ蛋白比值均顯著增加（P＜0.05），提示耐藥細胞中的細胞自噬被激活。見圖7。

圖7 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的細胞中P62、Beclin-1 和LC3 的蛋白表達Fig.7 Protein expression of p62、Beclin-1 and LC3 in MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.3 MGC-803 和MGC-803/OXA 細胞中自噬小體數(shù)量及結(jié)構(gòu) 透射電鏡觀察MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞中的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示與MGC-803相比，耐藥細胞株MGC-803∕OXA 細胞內(nèi)具有典型的、內(nèi)含胞漿成分的空泡狀雙層膜樣結(jié)構(gòu)的自噬體，且數(shù)量顯著增加，提示耐藥細胞株的自噬被激活。見圖8。

圖8 MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞自噬小體（A 和B×1.5 k，C 和D×6.0k）Fig.8 Levels of autophagy vesicles in MGC-803 and MGC-803∕OXA（A&B×1.5 k，C&D×6.0k）

2.4 自噬抑制劑3-MA 對MGC-803 和MGC-803/OXA 自噬水平的影響 5 mmol∕L 的3-MA 分別作用MGC-803 和MGC-803∕OXA 24 h 后，Western blot方法檢測P62、Beclin-1 和LC3Ⅱ∕Ⅰ蛋白的表達。結(jié)果提示，MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞在3-MA作用24 h 之后，細胞中P62蛋白表達升高，Beclin-1蛋白表達和LC3Ⅱ∕Ⅰ比值下降（P＜0.05），提示3-MA 可以抑制MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞的自噬水平。見圖9。

圖9 自噬抑制劑3-MA 對MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞自噬的影響Fig.9 Effect of autophagy inhibitor 3MA on autophagy of MGC-803 and MGC-803∕OXA

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，主要治療手段是手術(shù)治療結(jié)合放化療及靶向治療［11］，雖然目前新型化療藥和靶向藥物的開發(fā)提高了胃癌患者治療效果，延長了生存期［12-13］，但中晚期胃癌5年生存率仍然徘徊在27%左右［14］。藥物抵抗已成為限制晚期胃癌患者絕對生存時間的主要瓶頸。

耐藥機制一直尚未完全清楚，體外建立腫瘤耐藥細胞株是研究腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥機制的重要手段，也是耐藥機制研究的實驗基礎(chǔ)，所以運用藥物刺激建立耐藥株使得探索其機制成為了可能。本研究采用OXA 濃度梯度遞增誘導(dǎo)法，間歇藥物誘導(dǎo)MGC-803 使其獲得耐藥，起始的OXA 濃度為0.1 μg∕mL，通過逐步快速遞增培養(yǎng)液中OXA 濃度，對MGC-803 進行體外誘導(dǎo)和篩選，大約6 個月獲得了最終可在4 μg∕mL 的OXA 濃度中穩(wěn)定生長的耐藥細胞株MGC-803∕OXA，其耐藥性是親本株的7.04 倍，且在脫離OXA 培養(yǎng)1 個月以及將細胞凍存3月后再復(fù)蘇發(fā)現(xiàn)其仍能較好生長并增殖，耐藥性基本保持穩(wěn)定（RI = 7.0），按此標(biāo)準(zhǔn)劃分建立的細胞株為中度耐藥［15］。在倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，相較于親本細胞MGC-803，耐藥細胞MGC-803∕OXA 形態(tài)發(fā)生明顯改變，大小不均一，形態(tài)不規(guī)則，邊界欠清晰，細胞體積增大，核大、色深，不規(guī)則，折光性變強，細胞增殖緩慢，死亡細胞較多。從細胞周期分布可以看出，經(jīng)過OXA 誘導(dǎo)后MGC-803∕OXA 耐藥細胞株對數(shù)生長期的增殖速度明顯減慢，MGC-803∕OXA 的G0∕G1 期分布略有增加，S期分布明顯減少，G2∕M 期分布明顯延長，提示MGC-803 細胞經(jīng)OXA 誘導(dǎo)作用后，其細胞周期分布發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為G2∕M 期延長。這與徐宗斌等［16］建立的耐藥細胞株結(jié)果相似。從細胞凋亡結(jié)果可以看出，MGC-803∕OXA 細胞凋亡細胞數(shù)分布明顯少于MGC-803，這與任靜等［17］所建立的耐藥細胞株結(jié)果相似，說明MGC-803 耐藥細胞株的凋亡明顯受到抑制，細胞凋亡通路受到抑制也是腫瘤細胞耐藥的一個重要因素。MDR-1、MRP、ERCC1 基因異常表達與腫瘤的耐藥性產(chǎn)生關(guān)系較為密切。本研究檢測出MGC-803∕OXA 細胞中MDR-1、MRP、ERCC1mRNA 和蛋白表達較MGC-803 顯著升高，說明MGC-803∕OXA 細胞耐藥的產(chǎn)生，從而證明MGC-803∕OXA 細胞株為耐藥細胞株。

近年來越來越多的研究表明，化療可在腫瘤細胞中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［8，18］，自噬是機體的穩(wěn)態(tài)機制，細胞的基礎(chǔ)自噬水平較低，通過溶酶體降解細胞內(nèi)成分，包括錯誤折疊的蛋白質(zhì)、毒性聚合物和受損的細胞器等，從而維持細胞的存活［4-5］。當(dāng)營養(yǎng)匱乏、氧化應(yīng)激及化療等都可誘導(dǎo)細胞內(nèi)自噬的發(fā)生，從而為細胞適應(yīng)環(huán)境存活而提供條件。相關(guān)報道提示自噬和腫瘤細胞的化療耐藥相關(guān)，誘導(dǎo)自噬可導(dǎo)致肝癌和肺癌對順鉑產(chǎn)生耐藥［18］。而胃癌細胞在多種因素的作用下通過誘導(dǎo)自噬的發(fā)生促進癌細胞的生存［19］。因此，本研究首先需要明確胃癌的OXA 耐藥細胞株（MGC-803∕OXA）細胞的自噬水平。

自噬是一個動態(tài)過程，一般包括自噬泡（phagophore）產(chǎn)生、自噬體（autophagosome）形成、自噬體融合（fusion）及自噬體降解（degeneration）四個階段，自噬過程中自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，atg）及微管相關(guān)蛋白-3（LC-3）起到重要作用，Beclin1 是酵母菌Atg6 蛋白的哺乳細胞同源蛋白，是自噬發(fā)生過程中的核心蛋白，可作為評價自噬水平的指標(biāo)。LC3 是酵母菌Atg8 蛋白的哺乳動物同系物，在自噬小體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成及自噬泡修飾中起到重要作用，其羧基端被Atg4 迅速剪切，產(chǎn)生定位于胞漿的LC3-Ⅰ。在自噬體形成過程中，LC3-Ⅰ通過泛素樣反應(yīng)，結(jié)合到PE 上，產(chǎn)生脂質(zhì)化的LC3-Ⅱ，并定位到自噬體的膜上，是自噬體的重要標(biāo)志物，隨自噬體膜的增多而增加。本研究釆用了多種方法檢測胃癌耐藥細胞株MGC-803∕OXA 和親本細胞MGC-803 的自噬水平。首先，通過免疫印跡的方法發(fā)現(xiàn)，MGC-803∕OXA 中自噬相關(guān)蛋白P62 蛋白表達低于MGC-803 親本細胞，Beclin 1 表達和LC3Ⅱ∕Ⅰ的比值高于MGC-803 親本細胞。說明耐藥細胞株自噬被激活，自噬小體增多，而P62 蛋白表達減少，自噬體與溶酶體正常融合，自噬流正常。接著，通過透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)，更為直觀觀察到耐藥株MGC-803∕OXA 細胞比MGC-803 親本細胞具有更多典型的自噬體及溶酶體結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明OXA 耐藥的胃癌耐藥細胞株MGC-803∕OXA 和MGC-803 親本細胞均發(fā)生了自噬。為了進一步驗證自噬可以調(diào)控胃癌細胞對OXA 的耐藥性，本研究利用自噬抑制劑3MA 分別作用兩組細胞后，MGC-803∕OXA 和MGC-803 細胞自噬相關(guān)蛋白P62 蛋白表達量上調(diào)，而Beclin-1 的蛋白表達和LC3Ⅱ∕Ⅰ的比值均下調(diào)，自噬水平明顯受到抑制。本研究還發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑處理后，耐藥細胞株中MGC-803∕OXA 自噬水平下調(diào)比親本細胞更為顯著。這提示3MA 抑制了OXA 對自噬的激活作用，表明OXA 誘導(dǎo)的自噬，有利于維持耐藥細胞的存活，是胃癌細胞耐受OXA 的機制之一。

本研究成功構(gòu)建耐OXA 胃癌細胞株并探討了OXA 治療胃癌時的耐藥機制，為臨床尋找提高耐藥細胞對OXA 敏感性的方法以及尋找OXA 耐藥細胞高效低毒的耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供實驗基礎(chǔ)。下一步可以此為實驗基礎(chǔ)，通過細胞實驗和動物實驗進一步探討調(diào)控胃癌細胞耐藥的分子標(biāo)志物和治療靶點。