陳麗玲 徐振健 徐安平

【摘要】 目的 探討建立一種新型、簡(jiǎn)便易行的小鼠牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞（GMSC）體外提取及培養(yǎng)方法。方法 選擇C57BL/6小鼠，使用Ⅳ型膠原酶消化分離其牙齦組織，種板培養(yǎng)并傳代。利用細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）觀察小鼠GMSC的增殖規(guī)律，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠GMSC的細(xì)胞表面標(biāo)志物，進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，觀察所提取GMSC的多向分化潛能。結(jié)果 CCK-8試驗(yàn)顯示小鼠GMSC在培養(yǎng)第3～4日增殖活躍（第2～5日相鄰時(shí)間點(diǎn)間，P均< 0.05），第5日開始增殖進(jìn)入平臺(tái)期（第5～8日的相鄰時(shí)間點(diǎn)間比較，P均> 0.05）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與小鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞相比，GMSC高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90和CD105（P均< 0.05），幾乎不表達(dá)CD34、CD45（P均> 0.05）;多向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，GMSC成功分化為對(duì)應(yīng)的組織細(xì)胞，證實(shí)了GMSC的多向分化功能。結(jié)論 本研究成功提取小鼠GMSC，首次發(fā)現(xiàn)了一種新的、操作簡(jiǎn)便的、對(duì)原代細(xì)胞傷害少且有較高細(xì)胞獲得率的科學(xué)提取GMSC方法，并鑒定了其細(xì)胞標(biāo)志物和分化功能。

【關(guān)鍵詞】 牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞;提取培養(yǎng);誘導(dǎo)分化;鑒定

【Abstract】 Objective To establish a novel and simple method for isolation and culture of mouse gingival mesenchymal stem cells （GMSCs） in vitro. Methods The gingival tissues from C57BL/6 mice were separated and digested with type IV collagenase， cultured in a dish and passaged. The proliferation pattern of mouse GMSCs was investigated by Cell Counting Kit-8 （CCK-8） assay. The surface markers of GMSCs were detected by flow cytometry， and adipogenic and osteogenic differentiation experiments were carried out to explore the multi-directional differentiation potential of the extracted GMSCs. Results CCK8 assay showed that mouse GMSCs actively proliferated at 3 to 4 d after culture （all P < 0.05 between any two consecutive days from 2nd to 5th d）， and began to become steady on day 5 （all P > 0.05 between any two consecutive days from 5th to 8th d）. Flow cytometry showed that GMSCs highly expressed CD29， CD44， CD73， CD90 and CD105 （all P < 0.05）， but basically did not express CD34 and CD45 compared with mouse oral mucosal epithelial cells （both P > 0.05）. Multi-directional differentiation induction experiment demonstrated that GMSCs successfully differentiated into corresponding tissue cells， confirming the multi-directional differentiation potential of GMSCs. Conclusions In this study， mouse GMSCs are successfully isolated by a new and simple method for the first time， which causes slight damage to primary cells and yields high cell acquisition rate. The cell markers and differentiation function are also identified.

【Key words】 Gingival mesenchymal stem cell; Isolation and culture; Induction differentiation; Identification

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）具有自我更新、多能分化和免疫調(diào)節(jié)的作用。近年研究顯示，MSC可在包括變應(yīng)性結(jié)膜炎、變應(yīng)性鼻炎、急性青光眼、阿爾茨海默病和1型糖尿病等多種疾病中發(fā)揮治療作用[1-6]。MSC可以從不同的組織中分離出來，包括骨髓、臍帶、胎盤、脂肪組織和人的牙齦[7]。牙齦MSC（GMSC）是一種從牙齦組織中獲得的MSC亞群，2009年Zhang等首次從人牙齦組織中分離出GMSC，并證實(shí)了其表型及功能活性[8]。與其他MSC類似，GMSC也具有抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。小鼠和人源化動(dòng)物模型研究顯示，GMSC能夠通過減少效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞和增加調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞等治療包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、SLE、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病[7， 9-14]。既往文獻(xiàn)提及的小鼠GMSC的提取方法需使用多種酶及復(fù)雜的培養(yǎng)基等[15-16]。本研究以C57BL/6小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，旨在建立更為簡(jiǎn)便、高效的GMSC體外提取及培養(yǎng)體系，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、動(dòng) 物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠5只，雌雄不限，8～10周齡，體質(zhì)量15～20 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵循減少、替代、優(yōu)化的倫理規(guī)范操作，做到充分考慮動(dòng)物的利益，善待動(dòng)物，防止或減少動(dòng)物的應(yīng)激、痛苦和傷害，尊重動(dòng)物生命，采取痛苦最少的方法處置動(dòng)物。

二、主要試劑

包括：α-MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清（FBS），均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Ⅳ型膠原酶、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、人胰島素、油紅O染液，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）購(gòu)自美國(guó)APExBio公司;結(jié)晶紫染液、茜素紅染液，均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;抗小鼠流式抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

三、培養(yǎng)液配制

原代細(xì)胞培養(yǎng)液為α-MEM培養(yǎng)基+20%FBS。完全培養(yǎng)液為α-MEM+10%FBS。成脂誘導(dǎo)液為α-MEM培養(yǎng)基+10%FBS+200 μmol/L吲哚美辛+10 mg/L胰島素+1 μmol/L地塞米松+500 μmol/L?IBMX。成骨誘導(dǎo)液為α-MEM+10%FBS+10 nmol/L地塞米松+50 mg/L抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1. 小鼠GMSC的分離培養(yǎng)

處死C57BL/6小鼠，取小鼠下頜骨，清除多余皮膚及肌肉組織，用含有5%雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗下頜骨多次。用注射器針頭輕輕分離磨牙區(qū)牙齦。收集分離到的組織于培養(yǎng)皿中，加入1 mg/L Ⅳ型膠原酶，于37 ℃中消化30 min，加入含有 FBS的α-MEM終止消化，離心，棄上清。將組織鋪于6孔板中，每孔加1 ml含20%FBS的α-MEM，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待2～3 d后細(xì)胞爬出，換液把剩余組織塊洗出，每孔加2 ml 20%FBS的α-MEM，3 d換1次液。細(xì)胞長(zhǎng)滿板底80%后傳代，傳代后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2. 小鼠GMSC的增殖能力檢測(cè)

按細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）說明書進(jìn)行操作，連續(xù)8 d在同一時(shí)間使用酶標(biāo)儀測(cè)量 450 nm 處的吸光度，根據(jù)結(jié)果繪制GMSC生長(zhǎng)曲線。

3. 小鼠GMSC的表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

將第2代 GMSC（約1×106個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞懸液用PBS洗滌2次，用100 μl PBS重懸后分別加入流式抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，4℃避光孵育20 min后，PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。

4. 小鼠GMSC的多向分化潛能誘導(dǎo)

成脂誘導(dǎo)分化：取第2代GMSC接種于6孔板，每孔約3×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿板底70%，更換培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液，每隔3 d換1次液。誘導(dǎo)21 d后，PBS洗滌細(xì)胞1次，4%多聚甲醛固定30 min，去離子水洗滌2次后油紅O染液染色20 min，蒸餾水清洗3次，干燥后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

成骨誘導(dǎo)分化：取第2代GMSC接種于6孔板，每孔約3×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿板底70%，更換為成骨誘導(dǎo)液，每隔3 d換1次液。誘導(dǎo)28 d后，PBS洗滌細(xì)胞1次，4%多聚甲醛固定30 min，去離子水洗滌2次后茜素紅染液染色30 min，蒸餾水清洗3次，干燥后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以? 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠GMSC的分離培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)2～3 d后，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可見原代細(xì)胞從組織爬出，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀（圖1A）?？梢娫?xì)胞培養(yǎng)至10～14 d時(shí)細(xì)胞鋪滿皿底80%（圖1B、C），可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

二、小鼠GMSC的增殖能力檢測(cè)結(jié)果

CCK-8法結(jié)果顯示，GMSC在第3～4日增長(zhǎng)最快，在第5～8日增長(zhǎng)變得緩慢，出現(xiàn)平臺(tái)期。普通光學(xué)倒置顯微鏡下可見GMSC在第3～4日數(shù)量增長(zhǎng)明顯，在第5～8日數(shù)量逐漸到達(dá)最大值，并進(jìn)入平臺(tái)期。各時(shí)間點(diǎn)的變化組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 339.90，P < 0.001）， 其中第0～2日、第5～8日的相鄰時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），第2～5日相鄰時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05），見圖2。

三、小鼠GMSC的細(xì)胞表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

小鼠GMSC高表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105，最高的表達(dá)率達(dá)90%及以上，CD73最高表達(dá)率高于70%，CD39最高表達(dá)率為26.3%，同時(shí)結(jié)果顯示所提取細(xì)胞幾乎不表達(dá)CD34、CD45，表達(dá)率均低于5%，說明所提取的細(xì)胞純度較高。以小鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞，可見GMSC的CD29（t = 2.686，P = 0.036）、CD44（t = 22.582，P < 0.001）、CD73（t = 3.183，P = 0.019）、CD90（t = 62.944，P < 0.001）、CD105（t = 8.590，P < 0.001）、CD39（t= 5.799，P < 0.001）的表達(dá)均高于對(duì)照細(xì)胞，兩者CD34（t = 1.572，P = 0.140）、CD45（t = -1.643，P = 0.151）表達(dá)相似，見圖3。

四、小鼠GMSC的成脂誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果

小鼠GMSC經(jīng)成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d后，分化為脂肪細(xì)胞并分泌出脂滴，經(jīng)油紅O染液染色后，在光學(xué)顯微鏡下可見葡萄串狀紅色脂滴形成，見圖4。

五、小鼠GMSC的成骨誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果

小鼠GMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后，細(xì)胞逐漸從長(zhǎng)紡錘形變?yōu)槎噙呅?，并呈多層覆蓋生長(zhǎng)，可見陸續(xù)出現(xiàn)小的鈣化。成骨誘導(dǎo)28 d后，小鼠GMSC經(jīng)茜素紅染液染色后可見紅褐色鈣化結(jié)節(jié)，見圖5。

討 論

近年來，GMSC在自身免疫性和炎癥性疾病中的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用越來越受到重視[17]。與其他組織來源的MSC相比，GMSC具有易于分離、便于獲取、增殖快、不具致瘤性、同源性好、免疫調(diào)節(jié)作用及再生功能強(qiáng)于其他MSC等優(yōu)點(diǎn)[18-20]。

目前，小鼠等動(dòng)物GMSC的提取方法為組織消化法或組織塊法：組織消化法使用膠原酶和分離酶消化分離的組織塊，再通過過濾器獲得單細(xì)胞懸液進(jìn)行種板，操作步驟繁雜，且多種酶的消化易對(duì)原代GMSC造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞提前分化失去其生物學(xué)特性;組織塊法則將沖洗無菌的組織塊直接種板，通過倒立培養(yǎng)瓶的方法獲取原代細(xì)胞，該法提取細(xì)胞數(shù)量少、效率低且成功率不穩(wěn)定[15]。

本研究將2種提取原代GMSC的方法相結(jié)合并加以改良，對(duì)分離的牙齦組織僅用Ⅳ型膠原酶消化半小時(shí)，然后把消化后的牙齦組織直接種板，2～3 d后可見細(xì)胞爬出。由此可見該改良方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①步驟過程簡(jiǎn)單、易操作;②僅用一種消化酶，減短了消化時(shí)間，不僅減少了消化酶對(duì)原代細(xì)胞的損傷，而且節(jié)約了試劑成本;③經(jīng)膠原酶處理的牙齦組織變軟后再進(jìn)行種板，更有利于種板后GMSC從組織中爬出，短時(shí)間內(nèi)有較高的細(xì)胞獲得率，節(jié)約時(shí)間成本，同時(shí)通過換液、傳代可進(jìn)一步純化細(xì)胞;④培養(yǎng)液成分更為簡(jiǎn)單。與組織消化法及組織塊法相比，新的提取GMSC方法更為簡(jiǎn)便、易行，見表1。

本研究中小鼠GMSC生長(zhǎng)曲線從一定程度上可反映GMSC的增殖規(guī)律，第3～4日增殖活躍，第5日始增殖進(jìn)入平臺(tái)期，第7～8日由于培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)過密，細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，數(shù)量有少許下降。本研究所提取的細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105，最高表達(dá)率均高于90%，CD73最高表達(dá)率高于70%，基本不表達(dá)造血細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45，最高表達(dá)率均低于5%，符合GMSC細(xì)胞標(biāo)志物特性，同時(shí)提示所取取的細(xì)胞純度較高。多向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，小鼠GMSC在各自特定誘導(dǎo)條件下成功分化成對(duì)應(yīng)組織，證實(shí)了GMSC的多向分化功能。本研究表明，改良法提取的GMSC具有快速增殖的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)通過該法所分離的細(xì)胞有較高的純度，且能表現(xiàn)多向分化的干細(xì)胞特性，因此該法提取GMSC是可行的。

對(duì)GMSC的相關(guān)研究表明，GMSC在倫理學(xué)、獲取方法和分化潛能等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種較好的MSC來源，在細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)等方面具有重要的研究意義[21-22]。本研究的動(dòng)物GMSC提取技術(shù)的研究與改良有助于促進(jìn)各類疾病動(dòng)物模型GMSC的自體移植的實(shí)現(xiàn)，有利于深入研究GMSC對(duì)疾病治療作用的可能機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-01-20）

（本文編輯：林燕薇）