羅斯威 姚亞超 鐘麗梅 胡亮杉 肖威 方曉琳 曹東林

【摘要】 目的 了解新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）患者與細菌性肺炎患者細胞因子的差異，探討新冠肺炎免疫病理機制，為新冠肺炎提供新的治療靶點。方法 收集輕型新冠肺炎患者（新冠肺炎組）、細菌性肺炎患者（細菌性肺炎組）和健康志愿者（健康對照組）3組各15份血清標本，進行48種細胞因子的檢測，比較3組間細胞因子表達譜的差異。檢測10例新冠肺炎患者在治療不同時間點的血清標本中48種細胞因子表達，分析其與新冠肺炎患者的臨床特征及疾病進展的相關(guān)性。結(jié)果 新冠肺炎組與細菌性肺炎組比較中，巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）、生長調(diào)節(jié)致癌基因α（GROα）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和TNF-β在新冠肺炎組中上調(diào)（P均< 0.05）。而 IL-10、IL-18、IL-2受體α和IFN-γ誘導(dǎo)的單核細胞因子（MIG）在細菌性肺炎組中上調(diào)（P均< 0.05）。巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）在新冠肺炎患者住院治療的第2周有明顯的下調(diào);單核趨化蛋白-1（MCP-1）的變化與新冠肺炎患者的核酸檢測結(jié)果變化一致。結(jié)論 新冠肺炎患者和細菌性肺炎患者體內(nèi)存在不同的細胞因子表達譜。M-CSF和MCP-1在新冠肺炎疾病進展中起著重要作用。

【關(guān)鍵詞】 新型冠狀病毒肺炎;細菌性肺炎;細胞因子;表達譜

【Abstract】 Objective To investigate the differences of cytokine profiles between patients with novel COVID-19 and bacterial pneumonia， unravel the immunopathological mechanism of COVID-19， and provide evidence for new therapeutic targets in COVID-19. Methods In this study， 15 serum samples were collected from mild COVID-19 patients （COVID-19 group）， bacterial pneumonia patients （bacterial pneumonia group）， and healthy controls （healthy control group）， respectively. The expression profile of 48 cytokines was determined to clarify the differences among three groups. The expression levels of 48 cytokines at different time points were measured in serum samples from 10 patients with COVID-19 to analyze their correlation with clinical features and disease progression. Results In the comparation between the COVID-19 group and the bacterial pneumonia group， the expression levels of MIF， GROα， GM-CSF and TNF-β were upregulated in COVID-19 patients（all P < 0.05）， whereas those of IL-10， IL-18， IL-2Rα and MIG were upregulated in patients with bacterial pneumonia（all P < 0.05）. The expression level of M-CSF was significantly downregulated in COVID-19 patients at the second week of hospitalization. The changes in the expression level of MCP-1 were consistent with the nucleic acid test results of COVID-19 patients. Conclusions The cytokine profiles differ between patients with COVID-19 and bacterial pneumonia. In addition， M-CSF and MCP-1 play critical roles in the progression of COVID-19.

【Key words】 COVID-19; Bacterial pneumonia; Cytokine; profile

在全球范圍內(nèi)傳播的新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的。該病毒是冠狀病毒科的一種單鏈RNA病毒，主要感染呼吸道和腸道，引起多種癥狀[1]。雖然大多數(shù)新冠肺炎患者僅有輕微或中度的癥狀，但也有一部分患者會發(fā)展為嚴重的肺炎乃至需要機械通氣的ARDS[2]。人類感染SARS-CoV-2的發(fā)病機制尚不清楚。目前尚未有針對該病毒的特效抗病毒藥物，因此該病的治療主要集中在對癥治療和氧療[3]。免疫功能是對侵入性病原體的強有力防御。機體受感染后，體內(nèi)活躍的免疫反應(yīng)被描述為細胞因子風(fēng)暴，表現(xiàn)為分泌大量的促炎細胞因子及趨化因子。細胞因子風(fēng)暴綜合征（CSS）可由多種疾病引起，在臨床上CSS通常表現(xiàn)為全身炎癥，MODS和炎癥因子水平迅速大幅度升高[4]。新冠肺炎患者體內(nèi)存在的CSS與包括ARDS在內(nèi)的廣泛組織損傷有關(guān)[5]。然而其與普通細菌性肺炎致病機制之間的差異仍未闡明。本研究選擇調(diào)控細胞間信號通路并在炎癥、急性或慢性疾病中發(fā)揮重要作用的48種細胞因子，評價新冠肺炎患者和細菌性肺炎患者、健康人的細胞因子特征差異，以明確新冠肺炎與細菌性肺炎細胞因子表達譜間的差異，為開展針對性防控新冠肺炎提供科學(xué)理論依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象

選擇2020年1月24日至3月6日在廣東省第二人民醫(yī)院住院治療的15例輕型新冠肺炎患者（新冠肺炎組），共收集其住院前和住院后不同時間點的57份血清樣本，該批樣本均為常規(guī)生化檢查后的剩余血清樣本。診斷標準依據(jù)《新冠肺炎診療方案》（試行第五版）：SARS-CoV-2核酸檢測陽性，有發(fā)燒、干咳等臨床表現(xiàn)，且CT顯示肺部有毛玻璃狀陰影。收集同期住院的15例細菌性肺炎患者（細菌性肺炎組），診斷標準為：SARS-CoV-2核酸檢測陰性，有肺炎臨床表現(xiàn)且痰液或血液培養(yǎng)出革蘭陽性或陰性菌。收集同期15名健康志愿者（健康對照組），入組標準為：SARS-CoV-2核酸檢測陰性，無任何不適。本研究經(jīng)廣東省第二人民醫(yī)院倫理委員會批準（批件號：2021-KZ-141-01），所有患者均已簽署知情同意書。

二、標本處理及48種細胞因子檢測

非抗凝血的收集步驟：3500轉(zhuǎn)/分離心5 min，在離體6 h內(nèi)收集常規(guī)生化檢查后的剩余血清樣本，凍存于?20℃?zhèn)溆?。采用細胞因?8-plex篩選檢測試劑盒以液相芯片法檢測48種細胞因子，按試劑盒說明書要求操作。在比較3組間差異表達的細胞因子時，新冠肺炎組與細菌性肺炎組均使用入院后首次采集的血清標本。從新冠肺炎組15例患者中選取動態(tài)血清數(shù)據(jù)較為完善的10例，收集其治療不同時間點的血清標本檢測48種細胞因子，分析其水平與新冠肺炎患者的疾病進展間的相關(guān)性，并從10例中選取3例，收集其核酸由陽性轉(zhuǎn)為陰性的動態(tài)追蹤的血清樣本共24份，分析細胞因子與新冠肺炎患者的疾病進展和細胞因子特征之間的相關(guān)性。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

使用Graphpad 8.0處理數(shù)據(jù)。3組受檢者的血清細胞因子水平采用Kruskal-Wallis H檢驗，若組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，再采用Nemenyi檢驗。新冠肺炎患者治療不同時間點的統(tǒng)計采用重復(fù)測量資料的方差分析，同一患者治療前和治療后第2周的數(shù)據(jù)采用配對t檢驗。檢驗水準：α= 0.05。

結(jié) 果

一、3組受檢者的臨床特征

新冠肺炎組中，男9例、女6例，年齡（42.7± 15.7）歲，淋巴細胞絕對值為（1.48±0.61）×109/L，3例合并基礎(chǔ)性疾病，分別為糖尿病、COPD和慢性肝臟疾病，初始癥狀主要為發(fā)燒、干咳、咳痰、氣促、咽痛、肌痛和腹瀉。細菌性肺炎組中，男9例、女6例，患者年齡（69.0±24.0）歲，淋巴細胞絕對值為（1.28±0.67）×109/L，9例合并基礎(chǔ)性疾病，分別為高血壓、糖尿病、COPD、慢性心力衰竭和腦梗死等多種疾病。健康對照組中，男8名、女7名，志愿者年齡（55.8± 15.0）歲，淋巴細胞絕對值為（2.09±0.58）×109/L。

二、僅在細菌性肺炎組中增多的細胞因子

與健康對照組比較，IL-2、IL-4、IL-10、IL-16、IL-17、IL-18、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、白血病抑制因子（LIF）和IFN-γ誘導(dǎo)的單核細胞因子（MIG）僅在細菌性肺炎組中升高（P均< 0.05），而在新冠肺炎組中未見升高（P均> 0.05），見圖1。

三、同時在細菌性肺炎組和新冠肺炎組中增多的細胞因子

與健康對照組比較，IFN-α2、巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）、IL-15、IL-2受體α（IL-2Rα）、生長調(diào)節(jié)致癌基因α（GROα）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）同時在細菌性肺炎組和新冠肺炎組中升高（P均< 0.05），見圖2。

四、僅在新冠肺炎組中水平發(fā)生變化的細胞因子

與細菌性肺炎及健康對照組比較，IFN-γ 誘導(dǎo)蛋白10 （IP-10）、巨噬細胞炎癥蛋白-1 β（MIP-1β）、IL-5、基質(zhì)細胞衍生因子-1α（SDF-1α）、IL-1受體拮抗劑（IL-1ra）、TNF-β和干細胞生長因子-β（SCGF-β）等細胞因子僅在新冠肺炎組中升高（P均< 0.05），見圖3。

五、細菌性肺炎組和新冠肺炎組差異表達的細胞因子

新冠肺炎組與細菌性肺炎組的比較中，MIF、GROα、GM-CSF和TNF-β 在新冠肺炎組中上調(diào)（P均< 0.05），而 IL-10、IL-18、IL-2Rα和 MIG在細菌性肺炎組中上調(diào)（P均< 0.05），見圖1～3。

六、新冠肺炎組中與疾病進展相關(guān)的細胞因子

新冠肺炎組中，與治療前相比，M-CSF的含量在治療第2周下降。在SARS-CoV-2核酸轉(zhuǎn)陰的進程中先下降隨后維持在一定水平;單核趨化蛋白-1（MCP-1） 的含量與SARS-CoV-2核酸陽性有關(guān)，即在SARS-CoV-2核酸轉(zhuǎn)陰的進程中MCP-1水平逐漸下降，見圖4。3例核酸由陽性轉(zhuǎn)陰性的新冠肺炎患者 MCP-1和 M-CSF 的動態(tài)變化見圖5。

討 論

新冠肺炎發(fā)病過程中（尤其是危重癥患者）會出現(xiàn)的許多癥狀和相關(guān)病理過程，均是由細胞因子和CSS引發(fā)的。在危重癥患者中，免疫反應(yīng)可能失控，因此細胞因子暴發(fā)類似于繼發(fā)性噬血細胞淋巴組織細胞增生癥，可能導(dǎo)致MODS，如果救治不及時，可造成患者死亡[6]。結(jié)合抗菌藥物和免疫療法的治療策略可能會產(chǎn)生更好的效果[7-8]。因此，本研究期望尋找新冠肺炎區(qū)別于細菌性肺炎的發(fā)生機制，闡明與新冠肺炎發(fā)病及與其病程密切相關(guān)的細胞因子，為后續(xù)開發(fā)加強抗病毒免疫和避免過度炎癥損害的免疫調(diào)節(jié)療法，以防止或減少導(dǎo)致器官損傷和疾病進展的細胞因子釋放的策略提供更多的證據(jù)。

本研究根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會SARS-CoV-2診療方案（試行第五版）納入了15例輕型新冠肺炎患者，并詳細分析了其血清細胞因子和趨化因子的變化。細胞因子在SARS-CoV-2感染的病理生理學(xué)中起著重要作用，已有報道IL-2、sIL-2Rα、IL-7、MCP-1、M-CSF、IFN-γ等多個細胞因子在SARS-CoV-2、SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）感染患者中升高[9-10]。本研究顯示，與健康對照組相比，入院時新冠肺炎組患者I型IFN中的IFN-α2、LIF、MIF、IL-5、IL-15、SDF-1α等13種細胞因子升高。既往文獻報道，重型新冠肺炎患者均存在CSS，2組間大部分細胞因子在發(fā)病不同階段水平相當(dāng)[11]。本研究表明，輕型新冠肺炎患者體內(nèi)也存在CSS。本研究所分析的新冠肺炎或者細菌性肺炎患者血清均為入院后首次采集的治療前的血清標本，新冠肺炎采血前患者未給予腎上腺皮質(zhì)激素、靜脈注射Ig或利巴韋林等免疫調(diào)節(jié)劑。本研究的輕型新冠肺炎患者中并沒有出現(xiàn)IL-1、IL-6和TNF-α的上調(diào)，提示包括IL-1、IL-6和TNF抑制劑的抗細胞因子療法不適用于輕型新冠肺炎患者。上述特異改變的細胞因子有可能作為細菌性肺炎和新冠肺炎的鑒別診斷標志物，此外對于合并細菌性肺炎感染的新冠肺炎患者的免疫治療具有一定的指導(dǎo)意義。

有研究者發(fā)現(xiàn)，新冠肺炎患者的IL-6水平可根據(jù)疾病的嚴重程度而有所不同[12]。文獻報道，使用妥珠單抗即IL-6受體的抗體治療新冠肺炎患者的效果差，并且沒有阻止其進展為繼發(fā)性噬血細胞淋巴組織細胞增多癥[13]。這表明IL-6可能是疾病進展的主要指標，但并不是唯一的驅(qū)動因素。與之相反的是，本研究中輕型新冠肺炎患者血清中IL-6未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義的上調(diào)，可能是樣本量差異，或者可能是不同亞型病毒導(dǎo)致的細胞因子改變情況不一致。阻斷IL-6受體的抗體妥珠單抗，用于臨床治療輕型新冠肺炎患者的免疫抑制療法值得商榷。筆者在比較新冠肺炎和細菌性肺炎2組細胞因子差異時發(fā)現(xiàn)，MIF、GROα、GM-CSF和TNF-β在新冠肺炎組有較高的表達水平，而 IL-10、MIG、IL-2Rα和IL-18 在細菌性肺炎中有較高的表達水平，提示這些細胞因子在不同類別病原微生物導(dǎo)致的肺炎中的免疫致病機制和機體反應(yīng)存在差異。

本研究進一步分析了上述細胞因子是否可以用來預(yù)測新冠肺炎的疾病進展，應(yīng)用新冠肺炎患者住院治療的不同時期收集的連續(xù)血清標本分析細胞因子在個體疾病進展中的動態(tài)變化。其中有3例患者的血標本收集時間點較多，與核酸檢測結(jié)果配合，可用于監(jiān)測細胞因子在病毒核酸轉(zhuǎn)陰過程中細胞因子的動態(tài)變化。結(jié)果顯示MCP-1在核酸檢測結(jié)果從陽性變?yōu)殛幮缘倪^程中明顯下降。這與之前報道MCP-1在新冠肺炎和SARS等疾病急性期早期迅速升高，并隨著疾病進展逐漸降低結(jié)論一致，進一步證實MCP-1與新冠肺炎患者的疾病進展相關(guān)[14-15]。

目前對人類感染SARS-CoV-2發(fā)病機制提出的假說認為重型新冠肺炎患者經(jīng)歷3個臨床階段：病毒血癥期、急性期和恢復(fù)期。急性期大約為發(fā)病后第7～14日，急性期患者病情加重，中性粒細胞、D-二聚體、血尿素氮和血清肌酐水平升高[16]。有文獻報道M-CSF水平在輕型新冠肺炎患者中升高，但并未詳細分析治療后第2周的改變情況，也沒有分析M-CSF動態(tài)變化與臨床特征的相關(guān)性[11]。本研究中，輕型新冠肺炎患者的M-CSF水平在住院治療第2周出現(xiàn)下降，推測新冠肺炎患者治療第2周M-CSF處于抑制狀態(tài)，隨后恢復(fù)期患者血清中M-CSF水平增高，維持到一定水平后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。提示M-CSF可用于監(jiān)測新冠肺炎患者的病程，并可用于新冠肺炎疾病療效評估。有學(xué)者對感染SARS-CoV-2早期康復(fù)者的單細胞RNA序列分析結(jié)果表明，IL-1β和M-CSF可能是與細胞因子風(fēng)暴相關(guān)的炎癥反應(yīng)新介質(zhì)[17]。本研究結(jié)果加深了對SARS-CoV-2感染的免疫病理機制的理解，并提出了使用針對這些細胞因子特別是M-CSF這一新的免疫調(diào)節(jié)劑治療策略。

綜上所述，本研究分析了新冠肺炎患者和細菌性肺炎患者鑒別診斷的標志物，與SARS-CoV-2感染病程密切相關(guān)的細胞因子MCP-1和M-CSF有望成為新冠肺炎病情監(jiān)測的標志物。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-11-09）

（本文編輯：林燕薇）