劉永月+許建鵬+李田田

摘要：本研究利用不同濃度（0.2%、0.4%、0.8%）秋水仙堿和2%二甲基亞砜（DMSO）混合溶液浸漬無毛黃瓜（2n=2x=14）萌動(dòng)種子4 h，并通過形態(tài)學(xué)和染色體鑒定相結(jié)合的方法，成功獲得了其同源四倍體新種質(zhì)（2n=4x=28）。結(jié)果表明：0.4%秋水仙堿和2% DMSO的混合溶液誘變加倍率為14%，誘導(dǎo)效果最好。與原二倍體相比，同源四倍體生長發(fā)育緩慢，節(jié)間變短，莖變粗；葉柄、子房和果實(shí)縮短變粗，葉面積、花器官變大，果形指數(shù)減??；保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)幾乎為原二倍體的2倍，氣孔變大，四倍體花粉大小不均，且存在少量四孔花粉粒。本研究結(jié)果豐富了黃瓜遺傳多樣性，為選育優(yōu)質(zhì)黃瓜品種提供理論基礎(chǔ)和豐富種質(zhì)資源，為創(chuàng)制與無毛基因（gl）有關(guān)的整倍體奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：無毛黃瓜；同源四倍體；誘導(dǎo)；鑒定

中圖分類號(hào)：S642.203 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）11-0021-05

Abstract The germinating seeds of glabrous cucumber （2n=2x=14） were immersed in different concentrations of mixed solution of colchicine （0.2%， 0.4%， 0.8%） and 2% dimethylsulfoxide （DMSO） for 4 hours. The autotetraploid （2n=4x=28） was obtained successfully by morphological and chromosome identifications. The results showed that the treatment with 0.4% colchicine and 2% DMSO for 4 hours had the best induction effect with the chromosome-doubled rate of 14%. Compared with their original diploid plants， the autotetraploid plants had slower growth and development， shorter internode， thicker stem， thicker and shorter petiole， ovary and fruit， larger size of leaves and flowers， lower fruit shape index， larger leaf stomata， unevener tetraploid pollen size and little quantity of quadri-aperture pollens. In addition， their chloroplast number of guard cells was almost 2 times of the original diploid plants. The results would enrich the genetic diversity and germplasm resources of cucumber， provide the theoretical basis for high quality breeding of cucumber and lay a foundation for creating euploid which was associated with the glabrous gene gl.

Keywords Glabrous cucumber； Autotetraploid； Induction； Identification

黃瓜（Cucumis sativus L.）屬葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis），栽培歷史悠久，種植廣泛，是世界性蔬菜作物之一，在人們?nèi)粘Ｊ卟讼M(fèi)中占有舉足輕重的地位。對(duì)黃瓜的遺傳研究歷來是生物學(xué)家及遺傳學(xué)家的研究重點(diǎn)，且從中發(fā)現(xiàn)了眾多類型及突變體。無毛突變型黃瓜最早由物理輻射獲得[1]。曹辰興等在黃瓜種質(zhì)資源研究中，于華北型品種‘大青把自交系中發(fā)現(xiàn)無毛黃瓜突變體[2]，在對(duì)無毛黃瓜莖葉表面皮毛性狀研究中發(fā)現(xiàn)其由一對(duì)核基因控制，且無毛基因?qū)龌虼嬖谥[性上位作用[3]。多倍體化被認(rèn)為是植物適應(yīng)和進(jìn)化的主要機(jī)制之一[4]，基因的加倍被認(rèn)為是植物進(jìn)化的加速器[5]，染色體加倍是植物尤其是有花植物進(jìn)化的原動(dòng)力[6]，倍性育種是育種學(xué)家進(jìn)行物種改良的重要途徑之一，同源四倍體是育種學(xué)和遺傳學(xué)研究中重要的中間材料。染色體倍性的增加可提高遠(yuǎn)源物種之間的可雜交性[7]。同源多倍體與其原二倍體雜交，得到各種非整倍體后可進(jìn)行該物種部分性狀基因定位和連鎖遺傳分析等方面的研究[8]。已有相關(guān)報(bào)道對(duì)黃瓜同源多倍體的合成條件做了初步說明[9]，但對(duì)無毛黃瓜對(duì)應(yīng)四倍體的合成未見相關(guān)報(bào)道。秋水仙堿能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期，染色體雖然縱裂，但細(xì)胞不分裂，不能形成兩個(gè)子細(xì)胞，因而使染色體加倍，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)的研究和植物育種中，是多倍體合成最好的藥劑之一。

本試驗(yàn)采用染色體倍性操作技術(shù)，利用秋水仙堿（colchicine）和二甲基亞砜（DMSO）混合溶液誘變二倍體無毛黃瓜（2n=2x=14），創(chuàng)制其同源四倍體（2n=4x=28）新種質(zhì)，旨在加深對(duì)黃瓜無毛性狀的研究，豐富黃瓜遺傳多樣性，為選育優(yōu)質(zhì)黃瓜品種提供依據(jù)和豐富種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

田間試驗(yàn)于2014年6月—2015年1月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站日光溫室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)在園藝中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試無毛黃瓜二倍體由華北型黃瓜品種‘大青把自交系突變而來。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 參考Mackiewicz（1996）等[9]的誘導(dǎo)方法，用0.2%、0.4%、0.8%三種濃度的秋水仙堿和2%二甲基亞砜的混合溶液（體積比=1∶1）浸泡0.1～0.5 cm胚根的萌動(dòng)種子各100粒，蒸餾水處理為對(duì)照，置于搖床（振蕩速度為50 r/min）上避光處理4.5 h，溫度控制在20～25℃。處理后的種子用清水沖洗干凈后播入育苗缽（10 cm×10 cm），單粒播種，兩葉一心時(shí)參照雷春等[10]的方法，初步篩選出疑似誘導(dǎo)株后定植。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 出苗后統(tǒng)計(jì)成活株數(shù)，計(jì)算成活率（成活株數(shù)/處理株數(shù)）；開花結(jié)果期觀察葉、花、果實(shí)和種子；測定葉長、葉寬、葉柄長、葉柄粗、葉片展開度；觀察葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞并進(jìn)行葉綠體計(jì)數(shù)；觀察花粉粒大小和形態(tài)。拉秧期測定株高、統(tǒng)計(jì)節(jié)數(shù)，計(jì)算平均節(jié)間長度。

1.2.3 染色體計(jì)數(shù) 參考陳勁楓等[11]的方法，略有改動(dòng)。晴天上午取黃瓜1～2 cm幼嫩卷須，改良Carnoys Ⅱ固定液（無水乙醇∶氯仿∶冰乙酸= 5∶2∶3）低溫暗處固定24 h，60℃下HCl（1 mol/L）解離15 min，取卷須頂部2～3 mm，改良型石炭酸復(fù)紅染液染色2～5 min，火焰干燥法制片，鏡檢。每個(gè)卷須觀察30個(gè)以上分裂相良好的分生細(xì)胞。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007作圖，DPS 7.05 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理間采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙堿對(duì)無毛黃瓜的誘導(dǎo)效果

二倍體無毛黃瓜經(jīng)過秋水仙堿處理后，出苗時(shí)間推遲，出苗后生長明顯遲緩，甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，子葉和第一片真葉明顯變小并向外翻卷皺縮，第一片甚至第二片真葉出現(xiàn)畸形，形似銀杏葉。由表1可以看出，隨著秋水仙堿濃度的增加，處理材料受抑制程度增大，誘導(dǎo)率在秋水仙堿濃度為0.4%時(shí)最大，形態(tài)學(xué)鑒定與染色體鑒定相符度較高，不同濃度相符度分別為85.71%、87.50%和77.78%。

2.2 無毛黃瓜二倍體與其同源四倍體形態(tài)學(xué)特征比較

同源四倍體植株與原二倍體相比在外部形態(tài)上有較大差異。同源四倍體植株生長發(fā)育遲緩，節(jié)間變短；莖變粗，與原二倍體有顯著差異；植株矮小，與二倍體差異極顯著；葉片邊緣褶皺，鋸齒明顯，顏色更濃綠，葉片變厚；葉片增大，葉長增加8.26%，與原二倍體差異不顯著，葉寬增加17.66%，與原二倍體差異極顯著；葉柄縮短變粗，葉柄長減少25.30%，與原二倍體差異顯著，葉柄直徑增加48.00%，與原二倍體差異極顯著；葉片展開度變大，與原二倍體差異極顯著，個(gè)別出現(xiàn)葉片夾角處重合現(xiàn)象（表2，圖1）。

在開花結(jié)果期，四倍體植株開花相對(duì)較遲，花朵較大且更鮮艷，雌花花瓣和雄花花瓣長度和寬度均明顯變大，雄花花瓣長度增加17.31%，與原二倍體差異顯著；寬度增加40.54%；萼片長度增加66.67%，與原二倍體有極顯著差異。雌花花瓣長度增加16.67%，寬度增加54.35%，萼片長度增加96.88%，與原二倍體均有極顯著差異。子房變短變粗，子房長減少30.00%，子房直徑增加82.93%，與原二倍體均有極顯著差異。此外，四倍體植株結(jié)果率降低，果實(shí)的果棱明顯，果形指數(shù)減少了36.51%，果實(shí)多呈“矮胖”狀，瓜長減少24.77%，果實(shí)直徑增加18.45%，二者均與原二倍體有極顯著差異（表3，圖1）。

2.3 無毛黃瓜二倍體與其同源四倍體解剖學(xué)特征比較

由表4可以看出，無毛黃瓜四倍體保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體個(gè)數(shù)與原二倍體差異極顯著，前者約為后者的2倍；四倍體氣孔器大小和氣孔口大小均與原二倍體差異極顯著，與原二倍體相比，氣孔器平均長度增加63.70%，平均寬度增加23.48%，氣孔口平均長度增加47.76%，平均寬度增加51.43%，均與原二倍體有極顯著差異?；ǚ哿Ｖ睆皆龃?5.84%，差異極顯著；四倍體花粉大小不太一致，甚至畸形，且有少量四個(gè)萌發(fā)孔的花粉粒存在，而二倍體花粉粒大小基本一致，幾乎全為三個(gè)萌發(fā)孔花粉粒，不存在四孔花粉粒（表4，圖2）。

3 討論與結(jié)論

3.1 無毛黃瓜四倍體誘導(dǎo)條件的選擇

秋水仙堿發(fā)現(xiàn)并運(yùn)用于植物人工加倍始于1937年[12]，目前仍然是植物多倍體誘導(dǎo)中運(yùn)用最多的化學(xué)試劑，且已有較多成功報(bào)道。二甲基亞砜（DMSO）在加倍中起到促進(jìn)秋水仙堿滲透的作用，而其本身并不能加倍[13，14]，但能有效提高誘變效率。本試驗(yàn)利用不同濃度秋水仙堿和2%二甲基亞砜（DMSO）對(duì)300粒無毛黃瓜種子進(jìn)行誘導(dǎo)，共獲得了27株同源四倍體材料。其中0.4%秋水仙堿和2%二甲基亞砜（DMSO）的混合溶液誘變加倍率為14%，誘導(dǎo)效果最好。濃度過低，秋水仙堿不能對(duì)細(xì)胞充分作用，誘導(dǎo)效果較差；濃度過高，雖然能達(dá)到一定的誘導(dǎo)率，但是對(duì)植株毒害作用嚴(yán)重。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)一些植物激素和幾類抗微管類除草劑，如：甲基胺草磷（amiprophos-metyl， APM）、氟樂靈（trifluralin）、戊炔草胺（propyzamide）、胺磺靈（oryzalin）等也具有使染色體加倍的功能[15-20]，且在某些植物上誘導(dǎo)效果優(yōu)于秋水仙堿[14，20]，而在黃瓜上應(yīng)用效果如何仍未可知，有待以后驗(yàn)證。本試驗(yàn)選用萌動(dòng)的種子作為處理材料，處在這一階段的細(xì)胞合成和代謝旺盛，易于發(fā)生突變；誘導(dǎo)時(shí)控制在20～25℃，該溫度范圍利于細(xì)胞分裂，從而提高誘導(dǎo)效率。

3.2 無毛黃瓜四倍體的鑒定

倍性鑒定是倍性育種的重要環(huán)節(jié)，快速、簡便、有效地鑒定出植株倍性能大大減少工作量，實(shí)現(xiàn)早期篩選和應(yīng)用，加速育種進(jìn)程。四倍體與二倍體在形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)上有很大差別，這些都可以作為鑒定指標(biāo)。杜勝利等研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目幾乎與植株倍性成正比[21]；管葦?shù)纫匀A北型黃瓜‘長春密刺二倍體為材料，獲得了對(duì)應(yīng)三倍體和四倍體黃瓜材料，發(fā)現(xiàn)三倍體和四倍體的氣孔長度和寬度與原二倍體相比均顯著增加[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，無毛黃瓜四倍體的保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體平均數(shù)目幾乎為原二倍體的二倍；氣孔器和氣孔口長度和寬度均比原二倍體大，呈現(xiàn)極顯著差異，與上述研究結(jié)果一致。但形態(tài)學(xué)鑒定需要比較豐富的經(jīng)驗(yàn)且要求研究者對(duì)植物遺傳規(guī)律有較為深入的研究；染色體鑒定雖然準(zhǔn)確，卻耗時(shí)耗力，制片難度系數(shù)較大。本試驗(yàn)形態(tài)學(xué)間接鑒定和染色體計(jì)數(shù)的直接鑒定結(jié)合運(yùn)用，提高了判斷和鑒定的準(zhǔn)確性。

參 考 文 獻(xiàn)：

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