朱 俊，喬平平，于曉霞，陳小燕，單倩倩***

（1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，南通226001，2 南通大學(xué)江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 南通大學(xué)附屬醫(yī)院放療科）

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，2020 年新增病例超過220 萬[1]。其死亡率也極高，據(jù)報(bào)道[1]全球每年有近百萬人死于肺癌。根據(jù)組織學(xué)類型和病理特征，肺癌可分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）。NSCLC 的死亡率高，治療靶點(diǎn)有限，約占所有肺癌病例的85%[2]。近來，越來越多的研究[3-5]表明，NSCLC的發(fā)生及發(fā)展與許多遺傳和表觀遺傳的改變有關(guān)。例如，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的突變與NSCLC 的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此針對(duì)抑制EGFR 酪氨酸激酶的治療取得了一定的臨床效果[6]。除編碼基因外，大量非編碼基因，特別是microRNAs（miRNAs）在NSCLC 中表達(dá)模式亦發(fā)生顯著改變，并在NSCLC 的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。

miRNA 是一組內(nèi)源性單鏈非編碼RNA 分子，長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，如代謝、凋亡、增殖、分化，并參與正常的生理功能。相反，調(diào)節(jié)異常的miRNA 與許多人類疾病有關(guān)，包括遺傳疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥[9-11]。前期研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，NSCLC 組織中大量miRNA 的表達(dá)發(fā)生了顯著改變，并與肺癌患者的生存率密切相關(guān)。因此，探索NSCLC中差異表達(dá)miRNA 的生物學(xué)功能，可為NSCLC 診斷和治療的轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供潛在的分子依據(jù)。

研究[14-15]表明，miR-140-3p 在NSCLC 的一種亞型肺鱗癌患者中表達(dá)下調(diào)，并確定其作為肺癌的潛在生物標(biāo)志物。本研究擬用miR-140-3p mimic 或inhibitor 轉(zhuǎn)染NSCLC 細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖率和遷移能力，評(píng)價(jià)miR-140-3p 對(duì)NSCLC 的生物學(xué)效應(yīng)，并進(jìn)一步分析miR-140-3p 的潛在靶基因及其生物學(xué)意義。

1 材料和方法

1.1 NSCLC 細(xì)胞株培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人NSCLC 細(xì)胞株A549（目錄號(hào)：GCC-LU0003RT/GCC-LU0003CS）和NCIH1299（目錄號(hào)：GCC-LU0005RT/GCC-LU0005CS）購自上?；蚩萍脊煞萦邢薰尽⒓?xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，A549 細(xì)胞使用DMEM-F12培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青霉素和1%鏈霉素）培養(yǎng)，NCI-H1299 細(xì)胞使用DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青霉素和1%鏈霉素）培養(yǎng)，每隔1 d 更換細(xì)胞培養(yǎng)基。使用Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen 公司）在A549 和NCI-H1299 細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic、mimic 對(duì)照、miR-140-3p inhibitor 或inhibitor 對(duì)照（廣州RiboBio 公司）。

1.2 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）為了確定miR-140-3p 及下游靶基因的表達(dá)，提取細(xì)胞總RNA，使用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和stemloop RT 引物（Ribobio），或HiScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和oligo-dT 引物（Vazyme）逆轉(zhuǎn)錄1 μg 的RNA，采用StepOne Real-time PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems）檢測(cè)miR-140-3p 及靶基因的表達(dá)水平。miR-140-3p Bulgle-loop miRNA qRT-PCR引物組（每組1 條RT 引物，1 對(duì)qPCR 引物）由Ribo-Bio 設(shè)計(jì)。靶基因引物采用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)，由上海生工合成，引物序列見表1。miR-140-3p 的相對(duì)表達(dá)水平用U6 作內(nèi)參，靶基因的相對(duì)表達(dá)水平使用GAPDH 作內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

表1 靶基因引物序列

1.3 EdU 增殖檢測(cè) A549 和NCI-H1299 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic、mimic 對(duì) 照、miR-140-3p inhibitor 或inhibitor 對(duì)照后，用Cell-light EdU DNA 細(xì)胞增殖試劑盒（RiboBio）檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀態(tài)，50 μmol/L EdU 處理2 h 后，再用Hoechst 33342 復(fù)染標(biāo)記所有的細(xì)胞。使用Leica DMR 熒光顯微鏡拍攝細(xì)胞顯微圖片，統(tǒng)計(jì)EdU 陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，最后測(cè)定細(xì)胞增殖率，計(jì)算公式：細(xì)胞增殖率/%=EdU 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.4 Transwell 遷移分析 分別將轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic、mimic 對(duì)照、miR-140-3p inhibitor 或inhibitor對(duì)照的A549 和NCI-H1299 細(xì)胞懸浮在不含血清的培養(yǎng)基中，然后將細(xì)胞懸液添加到直徑6.5 mm、孔徑8 μm 的Transwell 室的上腔室中，使細(xì)胞向含血清培養(yǎng)基的底部腔室遷移，培養(yǎng)36 h 后去除上腔殘留細(xì)胞，固定上腔底面的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。在Leica DMR 倒置顯微鏡下拍攝細(xì)胞顯微照片，觀察結(jié)晶紫染色區(qū)域，檢測(cè)細(xì)胞的縱向遷移能力。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染了miR-140-3p mimic、mimic對(duì)照、miR-140-3p inhibitor 或inhibitor 對(duì)照的A549和NCI-H1299 細(xì)胞，分別接種到帶有插片的培養(yǎng)模具中，插片寬1 mm，待細(xì)胞融合達(dá)到95%時(shí)去除插片，融合處留下1 mm 寬的缺口，繼續(xù)培養(yǎng)10 h，在Leica DMR 倒置顯微鏡下拍照，檢測(cè)缺口閉合情況。使用Image-Pro Plus 計(jì)算清潔區(qū)域面積，以確定細(xì)胞的橫向遷移能力。

1.6 miR-140-3p 的生物信息學(xué)分析 利用靶基因預(yù)測(cè)軟件miRWalk、RNA22、TargetScan 以及miRDB聯(lián)合預(yù)測(cè)miR-140-3p 的潛在靶基因；使用Cytoscape軟件，通過DisGeNet 工具檢索NSCLC 相關(guān)基因[16]；然后，借助維恩圖工具（Venny 2.1.0；http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），將幾種工具篩選到的基因取交集；最后，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均來自3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，定量數(shù)據(jù)以表示。使用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-140-3p 促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖 qRTPCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic 的A549 細(xì)胞中，miR-140-3p 的表達(dá)豐度顯著高于對(duì)照組，而轉(zhuǎn)染miR-140-3p inhibitor 的A549 細(xì)胞中，miR-140-3p 的表達(dá)豐度顯著低于對(duì)照組（圖1A），表明在A549 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic 或inhibitor分別增加或降低了miR-140-3p 的表達(dá)。然后，對(duì)轉(zhuǎn)染的A549 細(xì)胞進(jìn)行EdU 增殖檢測(cè)，觀察miR-140-3p 表達(dá)的改變是否會(huì)影響細(xì)胞增殖。EdU 染色結(jié)果顯示，miR-140-3p mimic 轉(zhuǎn)染后，處于增殖狀態(tài)的A549 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic 的A549 細(xì)胞中，EdU 陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比率是對(duì)照組的1.5 倍以上。相反，轉(zhuǎn)染miR-140-3p inhibitor 則導(dǎo)致EdU 陽性細(xì)胞的數(shù)量和比率降低（圖2A，見封二）。

圖1 轉(zhuǎn)染A549 或NCI-H1299 細(xì)胞后miR-140-3p 的表達(dá)水平

圖2 miR-140-3p 促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞增殖

另一種NSCLC 細(xì)胞，NCI-H1299 細(xì)胞，亦成功轉(zhuǎn)染了miR-140-3p mimic 和inhibitor（圖1B）。與A549 細(xì)胞觀察結(jié)果相似，轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic的NCI-H1299 細(xì)胞增殖率升高，而轉(zhuǎn)染miR-140-3p inhibitor 的NCI-H1299 細(xì)胞增殖率則降低（圖2B，見封二）。這些結(jié)果提示miR-140-3p 可以促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖。

2.2 miR-140-3p 抑制NSCLC 細(xì)胞的遷移 Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，A549 細(xì)胞可以從上腔室表面遷移至含血清的下腔室。然而，miR-140-3p mimic 轉(zhuǎn)染后，與對(duì)照組相比，遷移的細(xì)胞減少到50%以下；而miR-140-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染后，與對(duì)照組相比，遷移的細(xì)胞增加到3.5 倍以上（圖3A，見封二）。相應(yīng)地，miR-140-3p mimic 或inhibitor 轉(zhuǎn)染NCI-H1299 細(xì)胞后，獲得了相似的結(jié)果，細(xì)胞遷移亦明顯減少或增加（圖3B，見封二）。

圖3 miR-140-3p 抑制NSCLC 細(xì)胞的遷移

隨后，通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察miR-140-3p 對(duì)A549和NCI-H1299 細(xì)胞傷口愈合的影響。結(jié)果顯示，插片從細(xì)胞培養(yǎng)模室中取出后，各組產(chǎn)生了等寬的創(chuàng)面，在A549 細(xì)胞中，去除插片10 h 后，與對(duì)照組相比，miR-140-3p mimic 轉(zhuǎn)染后留下了更大的清潔區(qū)域。相比之下，miR-140-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染后與對(duì)照相比，清潔區(qū)域明顯減?。▓D4A、C，見封二）。類似的，轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic 的NCI-H1299 細(xì)胞相對(duì)清潔區(qū)域比對(duì)照組大，轉(zhuǎn)染miR-140-3p inhibitor 的NCI-H1299 細(xì)胞相對(duì)清潔區(qū)域則明顯減小（圖4B、D，見封二）。這些結(jié)果表明miR-140-3p 抑制了NSCLC細(xì)胞的遷移。

圖4 miR-140-3p 抑制NSCLC 細(xì)胞的創(chuàng)面愈合

2.3 miR-140-3p 下游靶基因及相關(guān)生物信息學(xué)分析 鑒于miRNA 通過抑制靶基因的表達(dá)參與機(jī)體病理生理調(diào)控的作用機(jī)制，利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)了miR-140-3p 的潛在靶基因。miRWalk、RNA22、TargetScan 和miRDB 軟件分別篩選了11 385、3 464、1 028 和697 個(gè)mRNA 作為miR-140-3p 的候選靶基因，利用維恩圖將篩選到的候選靶基因取交集，得到62 個(gè)共同靶基因（圖5A）。進(jìn)一步將這62 個(gè)靶基因與Cytoscape 軟件檢測(cè)的NSCLC 相關(guān)基因取交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDPK1（3-phosphoinositide dependent protein kinase 1）、INO80D（INO80 complex subunit D）、HGF、CDK6（cyclin dependent kinase 6）、NDC1（NDC1 transmembrane nucleoporin）、E2F7（E2F transcription factor 7）、BACE1（beta-site APP cleaving enzyme 1）、CBL、EZH1（enhancer of zeste homolog1）、HOXB5（homeo box B5）、HBP1、OTUD7B、CD274（CD274 molecule）、ADAM10（ADAM metallopeptidase domain 10）、TCF4（transcription factor 4）、SKIL（SKI-like proto-oncogene）共16 個(gè)基因存在重疊（圖5B～C）。接著，從這16 個(gè)潛在的靶基因中挑選已被證實(shí)[17-20]對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用的CBL、HBP1、HGF 及OTUD7B 共4 個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入miR-140-3p mimic 時(shí)，CBL 的表達(dá)水平被明顯抑制，而miR-140-3p inhibitor 則顯著提升了CBL 的表達(dá)，提示CBL 基因可能是miR-140-3p 在NSCLC 中發(fā)揮作用的潛在靶點(diǎn)（圖5D）。

圖5 miR-140-3p 潛在靶基因的預(yù)測(cè)

利用Cytoscape 軟件對(duì)潛在靶基因及密切相關(guān)的GO 和KEGG 通路進(jìn)行基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建并展示基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)及其生物學(xué)意義。其中INO80D、E2F7、HOXB5、HBP1 和OTUD7B 在GO 或KEGG 通路中均未富集到，因此未在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中展示?；蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，這些潛在靶基因參與的生物學(xué)功能主要分為磷酸肌酸-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號(hào)通路的正向調(diào)控、細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）刺激應(yīng)答的負(fù)調(diào)控、通過死亡域受體的外部凋亡信號(hào)通路、氧化應(yīng)激反應(yīng)中的細(xì)胞死亡、毒素運(yùn)輸、膜蛋白外域蛋白水解、黑色素瘤和慢性髓系白血病等（圖6，見封二）。

圖6 Cytoscape 軟件構(gòu)建miR-140-3p 潛在靶基因參與的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖

3 討 論

miRNA 異常表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)NSCLC 細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響NSCLC 疾病的嚴(yán)重程度。在本研究中，檢測(cè)了miR-140-3p 對(duì)A549 和NCI-H1299 兩種NSCLC 細(xì)胞株的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)miR-140-3p 能夠促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖，抑制NSCLC 細(xì)胞的遷移。

miR-140-3p 的生物學(xué)功能已經(jīng)在多種不同的細(xì)胞類型中進(jìn)行了研究。外周血單核細(xì)胞中miR-140-3p 表達(dá)被抑制后，可導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少、凋亡升高、分化抑制[21]。有報(bào)道稱miR-140-3p mimic 在動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞[22]和食管鱗癌細(xì)胞[23]中抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此前，有研究[24-25]報(bào)道了miR-140-3p 對(duì)NSCLC 細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)miR-140-3p mimic 轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞活力和遷移受到抑制。本研究將miR-140-3p mimic 或inhibitor 分別轉(zhuǎn)染NSCLC 細(xì)胞，旨在獲得更全面的觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，miR-140-3p mimic 和inhibitor 對(duì)NSCLC 細(xì)胞行為產(chǎn)生了相反的影響，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-140-3p促進(jìn)了NSCLC 細(xì)胞的增殖率，但抑制了NSCLC 細(xì)胞的遷移能力。

本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果與之前報(bào)道的不一致，因?yàn)閙iR-140-3p 的下游靶基因較多，推測(cè)這可能與不同細(xì)胞中miR-140-3p 作用的靶基因不同有關(guān)。CBL 是細(xì)胞增殖的抑制分子，已有報(bào)道[17]miR-940 通過抑制CBL 的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，本研究的檢測(cè)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-140-3p 顯著抑制了CBL 的表達(dá)，而miR-140-3p 的表達(dá)被抑制后，CBL 的表達(dá)水平則顯著提升，提示CBL 有可能是miR-140-3p 發(fā)揮效應(yīng)的靶點(diǎn)，這還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。除了對(duì)細(xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與之前的觀察一致，均顯示miR-140-3p 抑制了NSCLC 細(xì)胞的遷移能力。對(duì)miR-140-3p 潛在靶基因的功能注釋顯示，miR-140-3p 及其靶基因，特別是PDPK1 和SKIL，與細(xì)胞對(duì)TGF-β 刺激應(yīng)答負(fù)調(diào)控的生物學(xué)過程緊密相關(guān)。有報(bào)道稱miR-140-3p 是TGF-β3（TGF-β 家族成員）的直接上游調(diào)控因子[26]，TGF-β 的過度表達(dá)和（或）激活可以增加NSCLC 細(xì)胞的活力和遷移能力[27]。因此，在NSCLC 中下調(diào)miR-140-3p 可能導(dǎo)致TGF-β 信號(hào)通路升高，提高NSCLC的生存能力和遷移能力。此外，TGF-β 也被認(rèn)為是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程中重要的誘導(dǎo)因子[28]，EMT 程序在癌癥中被激活后，與癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[29]。因此，miR-140-3p 也有可能通過影響EMT 過程，進(jìn)而參與NSCLC 的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，通過聯(lián)合使用miR-140-3p mimic 和inhibitor，綜合評(píng)價(jià)了過表達(dá)或抑制miR-140-3p 對(duì)NSCLC 細(xì)胞功能的影響，發(fā)現(xiàn)miR-140-3p 可以促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖，抑制其遷移能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于更全面地理解miR-140-3p 對(duì)NSCLC 細(xì)胞行為的調(diào)控，為進(jìn)一步深入研究miR-140-3p 對(duì)NSCLC 細(xì)胞的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。