徐靖昂，王雪兒，祝倩倩，范美華，嚴(yán)小軍，張曉林

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022）

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國重要的經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)業(yè)之一，是中國經(jīng)濟(jì)可持續(xù)提高的主要增長點(diǎn)。近年來，我國淡水池塘集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖技術(shù)與水平提高，各種新型高產(chǎn)效的養(yǎng)殖模式興起[1]。池塘養(yǎng)殖的水體既是養(yǎng)殖對象的生存場所，又是殘餌和養(yǎng)殖對象糞便的分解場所[2]。在高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖對象產(chǎn)生的代謝物不能被及時(shí)降解，導(dǎo)致水體中氨氮和亞硝氮等有害物質(zhì)逐漸增多，水體pH 偏高，進(jìn)而出現(xiàn)水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象，對水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益和人類健康發(fā)展造成嚴(yán)重危害[3]。有研究認(rèn)為綠藻類和硅藻類具有吸收有害物質(zhì)、保持水質(zhì)“活、爽”的功能，是可用來構(gòu)建優(yōu)良藻相的備選種類[4]。此外，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，溫度也是一項(xiàng)很重要的環(huán)境因素，它影響著養(yǎng)殖水體中浮游微藻的分布。對于大多數(shù)微藻來說，最適溫度在18～25 ℃[5]，但冬季水體溫度較低，對浮游微藻的分布生長有一定影響。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)對水質(zhì)惡化等生態(tài)問題，物化處理法存在投入成本高、實(shí)踐操作復(fù)雜、易產(chǎn)生二次污染等問題，實(shí)際應(yīng)用范圍局限；而生物法具有運(yùn)行成本較低，使用安全，無化學(xué)試劑添加，二次污染可能性低，能獲得安全、高品質(zhì)的產(chǎn)品等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[6]。現(xiàn)有的試驗(yàn)結(jié)果表明微藻有調(diào)節(jié)水體中的氮磷元素含量[7]，抑菌[8]，改善養(yǎng)殖水環(huán)境等方面的功能。

柵藻Scenedesmus sp.作為一種耐受性強(qiáng)，去除水體污染物效果好的綠藻[9]，常被用于水體凈化。程海翔[10]使用柵藻去除適當(dāng)滅菌后的養(yǎng)豬場沼液中的氮磷，去除率分別可達(dá)到98.2%、80.4%。劉林林等[11]比較了15種微藻對養(yǎng)豬廢水中總氮、總磷的去除能力，發(fā)現(xiàn)多棘柵藻Scenedesmus spinosus 的總氮去除率最高（93.25%），多棘柵藻和四尾柵藻S.quadricauda 的總磷去除率可達(dá)到97%以上。柵藻在適合的條件下，也可以產(chǎn)生油脂和蛋白質(zhì)等附加產(chǎn)物[12-13]。

本文主要針對1 株分離自淡水養(yǎng)殖池塘的微藻，首先對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，然后探究其細(xì)胞形態(tài)特征和不同條件下的生長規(guī)律，最后采用紫外（UV）誘變和化學(xué)（EMS）誘變技術(shù)，對該藻株進(jìn)行隨機(jī)誘變，獲得大量突變株，通過強(qiáng)堿、低溫等極端條件培養(yǎng)對突變株進(jìn)行篩選，獲得能夠耐受強(qiáng)堿和低溫的優(yōu)良藻株。以期為該柵藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控中的廣泛適用性提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻株分離及純化

實(shí)驗(yàn)藻株由武漢中易天地物聯(lián)科技有限公司提供。藻種接種于15 mL BG11 液體培養(yǎng)基，4 000 lx 光強(qiáng)的光照培養(yǎng)箱（ZRG-250B-L3）中復(fù)蘇培養(yǎng)，光暗周期為12 h（L/D：12/12 h），25±1 ℃。將活化后的藻株轉(zhuǎn)接至250 mL BG11 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d，梯度稀釋后涂布，選擇長勢優(yōu)良的單藻落連續(xù)劃線分離，將單克隆藻株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。為確保藻株的純度，利用96 孔板梯度稀釋分離法對該藻株再次分離純化，取100 μL藻液于96 孔板中，加入100 μL 無菌BG11 培養(yǎng)液混勻，取100 μL 已稀釋藻液連續(xù)梯度稀釋，直到最后1個(gè)稀釋梯度長出的為單個(gè)藻細(xì)胞為止。吸取該孔內(nèi)的藻液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并在固定平板上保存藻種。

1.2 形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

收集一定數(shù)量的藻液，離心棄上清，采用光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡相結(jié)合的方法，觀察微藻形態(tài)結(jié)構(gòu)與周期性形態(tài)變化。微藻形態(tài)學(xué)鑒定后，對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。收集藻液50 mL，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清，液氮速凍后研磨成粉。將TaKaRaMiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit 提取的DNA 作為模板，使用18S rRNA（F：CGGGATCCGTAGTCATATGCTTGTCTC;R：CGGAATTCCTTCTGCAGGTTCACC）和SSU rRNA（F：GTAGTCATATGCTTGTCTC;R：TCACCAGCACACCCAAT）特異性引物對微藻的18S rRNA 和SSU rRNA 基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系為50 μL，其中雙蒸無菌水34.75 μL，dNTP 4 μL，10×Ex taq buffer 2 μL，DNA 模板2 μL，Ex taq 酶0.25 μL，正反引物各2 μL。18S rRNA 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，72 ℃再延伸10 min，30 個(gè)循環(huán)。SSU rRNA 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，72 ℃再延伸10 min，30 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后的PCR 經(jīng)1.3%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，送至上海生工生物工程公司測序。將微藻的18S rRNA 和SSU rRNA 序列與GenBank中的一些近緣藻序列用MEGA7.0 進(jìn)行多序列比對分析，并采用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3 生長曲線測定及強(qiáng)堿、低溫下的生長情況

將柵藻接種到BG11 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)39 d。每天重復(fù)取樣品3 次，以空白BG11 液體培養(yǎng)基作為對照，采用紫外分光光度計(jì)測定樣品在波長為680 nm[14]處的OD 值，OD 值取平均值。同時(shí)采用LUNA 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對3 個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，記錄測得的藻細(xì)胞密度并取平均值。設(shè)置強(qiáng)堿（pH 10，25 ℃）、低溫（pH 7，10 ℃）、強(qiáng)堿與低溫協(xié)同（pH 10，10 ℃）3 組實(shí)驗(yàn)，定時(shí)測定藻液的OD680，平行3 組，方法同生長曲線測定。

1.4 紫外（UV）誘變及甲基磺酸乙酯（EMS）誘變

各取3 mL 對數(shù)生長期的藻液均勻平鋪于六孔板，19 W 紫外光強(qiáng)垂直于六孔板上方30 cm 進(jìn)行0、5、10、15、20、25 min 梯度照射，平行3 組。暗處理12 h 后按原條件培養(yǎng)。

各取6 組50 mL 處于對數(shù)生長期的藻液于50 mL 離心管，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS 緩沖液（pH 7）重懸，設(shè)置誘變劑EMS 濃度梯度：0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，緊蓋，暗環(huán)境搖床搖晃誘變60 min。各管加入3 mL 5%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。原速離心5 min 去除誘變液，各管以50 mL PBS 緩沖液沖洗藻細(xì)胞，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清，即為第1 次洗滌。各管內(nèi)加入50 mL BG11 液體培養(yǎng)基，以上述離心條件進(jìn)行第2 次洗滌。用培養(yǎng)基洗滌2 次后將所得藻細(xì)胞加培養(yǎng)基懸浮至50 mL，依次加入六孔板中，每孔5 mL，平行3 組，封口膜封邊后按原條件培養(yǎng)。

1.5 耐強(qiáng)堿、低溫突變株的篩選

將六孔板分別轉(zhuǎn)至10 ℃、pH 10 環(huán)境培養(yǎng)，其他條件不變。與未經(jīng)誘變處理的藻液對比，長勢較好的藻為突變株。吸取六孔板中的突變藻株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并做好相關(guān)保種工作，備用。

分別設(shè)置強(qiáng)堿（pH 10，25 ℃）、低溫（pH 7，10 ℃）、強(qiáng)堿與低溫協(xié)同（pH 10，10 ℃），其他同原培養(yǎng)條件。各取3 mL 相同濃度對數(shù)生長期的野生型藻株與突變型藻株藻液至250 mL 培養(yǎng)液中，每天或隔天定時(shí)測定藻液的OD680，平行3 組，方法同生長曲線測定。

2 結(jié)果

2.1 微藻形態(tài)結(jié)構(gòu)及其周期性變化

柵藻在光學(xué)顯微鏡下呈綠色，細(xì)胞形狀呈卵形，常聚集成群，個(gè)別細(xì)胞單生。電子顯微鏡下觀察，單個(gè)細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞表面平滑，細(xì)胞表面含有多個(gè)周生。光鏡（圖1）與電鏡（圖2）相結(jié)合觀察發(fā)現(xiàn)：藻細(xì)胞壁不同程度膠化。兩端具短錐狀增厚，分裂過程中（圖1）母細(xì)胞壁作為子細(xì)胞的似親孢子囊。光鏡觀察藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：大量藻細(xì)胞聚集，細(xì)胞中央近圓且飽滿，處快速分裂時(shí)期，囊中含有2-4-8 個(gè)似親孢子，貼合緊密但互不相連（圖1D）；邊緣細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞衰老，具大量細(xì)胞破裂后釋放的內(nèi)含物質(zhì)（圖1 E、F）。細(xì)胞成熟后具蛋白核、淀粉鞘、淀粉粒等組成，其中淀粉鞘與淀粉粒具有較強(qiáng)的折光性。柵藻是淡水水體中常見的微藻，常常以聚集的方式存在。但是在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)，出現(xiàn)了單生藻細(xì)胞，有研究表明，柵藻在室內(nèi)培養(yǎng)，可以形成單生細(xì)胞，不聚集生長[15]。

圖1 柵藻光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)Fig.1 OM graphed of Scenedesmus sp.

圖2 柵藻掃描電鏡（左）及透射電鏡（右）Fig.2 Scenedesmus sp.scanning electron microscope（left）and transmission electron microscope（right）

2.2 18S rRNA 和SSU rRNA 基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

對微藻的18S rRNA 和SSU rRNA 序列擴(kuò)增，得到的序列用BLAST 進(jìn)行分析，選取GenBank 中已有的近緣藻株序列，用鄰接法構(gòu)建18S rRNA 和SSU rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹。分離純化所得微藻與已知藻株Scenedesmus raciborskii（登錄號(hào)：AB037094.1）位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個(gè)分支上，具有較近的親緣關(guān)系（圖3）。因此，基于18S rRNA 和SSU rRNA 的序列相似性和其他相似序列多序列比對的系統(tǒng)發(fā)育分析表明本研究中分離到的藻株屬于柵藻。將該柵藻正式命名為Scenedesmus sp.ZJZY091，18S rRNA 和SSU rRNA測序結(jié)果已提交至GenBank（18S rRNA 登錄號(hào)：OK 644024；SSU rRNA 登錄號(hào)：OL813869）。

圖3 基于18S rRNA 部分序列（左）及SSU rRNA 部分序列（右）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on the partial sequence of 18S rRNA（left）and the partial sequence of SSU rRNA（right）

2.3 柵藻生長曲線的測定

測定了該柵藻的生長曲線，發(fā)現(xiàn)柵藻的生長周期較長，以測定數(shù)據(jù)下降為數(shù)據(jù)測定終點(diǎn)，該培養(yǎng)條件下柵藻的生長周期達(dá)39 d。從圖4 可以看出，柵藻在接種后6～7 d 時(shí)進(jìn)入緩慢生長期，自第14 天開始，藻細(xì)胞開始快速擴(kuò)增，進(jìn)入對數(shù)生長期，在第30 天，藻細(xì)胞增殖的速度減慢，進(jìn)入平臺(tái)期，在接種后第39 天進(jìn)入衰退期。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，該柵藻的最大OD 值可達(dá)到1.2 左右。

圖4 柵藻的生長曲線Fig.4 The growth curve of Scenedesmus sp.

2.4 不同培養(yǎng)條件對柵藻生長的影響

測定了該柵藻在高pH、低溫以及2 個(gè)條件共同作用下的生長情況。結(jié)果顯示柵藻細(xì)胞在pH 10 的條件下生長受到抑制，且藻細(xì)胞發(fā)生聚團(tuán)現(xiàn)象，培養(yǎng)基底與表面貼壁部位均有分布，搖晃后藻團(tuán)不分散（圖5A）。進(jìn)入衰老期后，藻液轉(zhuǎn)為黃綠色，經(jīng)搖晃后，藻聚團(tuán)沉底（圖5B，C），藻細(xì)胞破碎后會(huì)釋放內(nèi)含物質(zhì)（圖5E，F(xiàn)）。有研究表明，pH 一般通過影響細(xì)胞內(nèi)代謝酶的活性和藻細(xì)胞對離子的吸收利用，從而影響微藻的生理代謝[16]。不同的藻類生長的最佳pH 不同，偏離最佳pH，微藻生長和體內(nèi)有關(guān)代謝活動(dòng)會(huì)受到抑制[17]。例如，鈍頂螺旋藻Spirulina platensis最適生長的pH 為9.0～9.6，高pH 會(huì)影響細(xì)胞的形態(tài)[18]，這與本研究的結(jié)果一致。

圖5 強(qiáng)堿對柵藻形態(tài)及生長的影響Fig.5 The effect of strong alkali on the morphology and growth of Scenedesmus sp.

在10 ℃條件下培養(yǎng)的柵藻與對照組（25 ℃）相比，生長也被明顯抑制（圖6）。有研究表明溫度是影響微藻生長和代謝的重要環(huán)境因子之一[19]。各類藻對溫度的適應(yīng)范圍不同，如小新月菱形藻Nitzschia closterium f.minutissima 適應(yīng)溫度范圍為10～25 ℃[20]，小球藻Chlorella sp.溫度范圍為20～35 ℃[21]。如果溫度超過微藻的最適范圍，微藻的生長將受到不同程度的影響[22]。高溫和低溫對微藻的危害不相同，高溫對微藻是化學(xué)性破壞，而低溫對微藻是機(jī)械性破壞，微藻一般對低溫的忍耐性較強(qiáng)[23]。本研究中，在低溫條件下，柵藻的生長受到抑制，這一結(jié)果與葉麗等[24]的研究結(jié)果一致。

圖6 低溫對柵藻生長的影響Fig.6 The effect of low temperature on growth of Scenedesmus sp.

柵藻在pH 10，10 ℃條件下生長受到明顯抑制，藻細(xì)胞出現(xiàn)聚團(tuán)現(xiàn)象，藻團(tuán)沉底（圖7C），搖晃后能較均勻分布于培養(yǎng)基中。結(jié)果顯示，強(qiáng)堿、低溫共同作用與原培養(yǎng)相比，二因素協(xié)同影響下的藻生長更遲緩。

圖7 強(qiáng)堿、低溫對柵藻生長的影響Fig.7 The effect of strong alkali and low temperature on the growth of Scenedesmus sp.

2.5 柵藻的誘變及耐強(qiáng)堿、低溫突變株的篩選

通過紫外和EMS 誘變后的突變株經(jīng)pH 10 以及10 ℃培養(yǎng)條件下的篩選，結(jié)果如圖8 所示，在強(qiáng)堿條件下，遲緩期與對數(shù)生長期間，野生株生長略優(yōu)于突變株，二者無明顯差異；平臺(tái)期突變株生長優(yōu)于野生株，突變株具有較好的強(qiáng)堿耐受性。如圖15 所示，自第18 天，突變株仍較野生株具有一定耐低溫的特性。與單一脅迫因素作用相比，強(qiáng)堿和低溫的協(xié)同作用使得2 種類型的柵藻比較明顯的某個(gè)時(shí)期更具生長優(yōu)勢，突變株柵藻生長出現(xiàn)波動(dòng)，具有不穩(wěn)定性。紫外線輻照是目前使用最久且成本低廉的一種物理誘變方法[25-26]。甲基磺酸乙酯（EMS）是一種常用的化學(xué)誘變劑，主要原理是在DNA 復(fù)制的過程中，通過改變堿基的結(jié)構(gòu)而達(dá)到誘變的目的[5]。有研究表明，紫外線輻照對不同微藻的生長速率、色素及代謝產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生不同程度的促進(jìn)作用和危害作用。在鈍頂螺旋藻的研究中[27]，紫外線輻照的突變株與野生株比較，藻絲長度增長，葉綠素含量、生長速率及光合速率均顯著提高。與單一誘變相比，復(fù)合誘變可以增加基因突變類型。經(jīng)過紫外誘變和EMS 誘變處理的水云屬褐藻Ectocarpus confervoides，發(fā)現(xiàn)紫外誘變比EMS 誘變產(chǎn)生更多的基因突變[28]。復(fù)合誘變更有利于篩選獲得性狀優(yōu)良的突變藻株[29-30]。本研究中，使用紫外和EMS 復(fù)合誘變篩選出了分別對強(qiáng)堿和低溫有抗逆性的藻株。

圖8 不同條件下野生株與突變株的生長情況Fig.8 Growth of wild type and mutant type under different environmental conditions

3 結(jié)論

本文從克氏原螯蝦養(yǎng)殖水體中分離到1 株微藻株，通過分離純化和鑒定，確定該藻隸屬于柵藻屬，該柵藻細(xì)胞含色素體、蛋白核、淀粉粒等微觀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)具周期性變化；且生長周期長，有明顯的遲緩期、對數(shù)期，穩(wěn)定期；強(qiáng)堿與低溫對柵藻的生長具有明顯的抑制作用，且強(qiáng)堿導(dǎo)致藻細(xì)胞聚團(tuán)；通過紫外和化學(xué)誘變處理藻株，并通過高pH 和低溫條件的篩選獲得耐強(qiáng)堿、耐低溫等具有適應(yīng)極端條件的突變株。本文的研究結(jié)果對于該柵藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖極端條件下的應(yīng)用提供可能。