王曉煜，勞敏軍，胡慧利，周 勇，吳益春，鄧尚貴，胡 藝，于 瑾

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江舟山 316000；3.杭州市質(zhì)量技術(shù)協(xié)會，浙江杭州 310019；4.舟山市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江舟山 316000；5.浙江恒和食品有限公司，浙江舟山 316000；6.龍游縣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，浙江龍游 324000）

大田軟海綿酸（okadaic acid，OA）是腹瀉性貝毒（diarrhetic shellfish poisons，DSP）的1 種，是一種主要存在于藻類植物中的小分子腹瀉性貝類毒素，主要是由利瑪原甲藻Procentrum lima 產(chǎn)生[1]，經(jīng)貝類攝入后富集在消化腺內(nèi)[2]。OA 是無色晶體，能溶于甲醇、乙醇和乙醚等有機溶劑，不溶于水，無色，無味，容易誤食，導(dǎo)致食物中毒[3]，引起腹瀉、惡心、嘔吐、腹痛等癥狀[4]。此外，OA 具有脂溶性和熱穩(wěn)定性，在加工過程中很難通過尋常的加工技術(shù)將其去除，甚至可能因貝類脫水及酯化態(tài)毒素向游離態(tài)的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致毒素的毒性增強。

目前OA 常見的檢測方法如小鼠生物測定法（MBA）[5]、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）[6]、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）[7]、蛋白質(zhì)磷酸酶抑制分析（PPIA）[8]、高效液相色譜（HPLC）[9]、電泳法[10]等。傳統(tǒng)的OA 檢測技術(shù)存在一定的局限性，通常需要昂貴的儀器，或者需要較長的檢測時間，無法滿足快速檢測的要求。

生物傳感器因其靈敏度高、快速便攜等優(yōu)勢在檢測領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注，核酸適配體也因其能與目標(biāo)物如重金屬離子、毒素、抗生素或病毒等高親和力、高特異性結(jié)合的特點，得到廣泛的應(yīng)用[11]。本研究基于磁分離富集核酸適配體技術(shù)，構(gòu)建了一種核酸適配體比色傳感器，用于快速檢測大田軟海綿酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大田軟海綿酸（okadaic acid，OA，（8.4±0.4）μg·mL-1）、鰭藻毒素-1（dinophysistoxin1-b，DTX-1（10.4±0.8）μg·mL-1）和鰭藻毒素-2（dinophysistoxin2-b，DTX-2，（3.8±0.2）μg·mL-1）標(biāo)準(zhǔn)品購自加拿大國家海洋研究中心，大田軟海綿酸適配體序列為5′-GGTCACCAACAACAGGGAGCGCTACGCGAAGGGTCAATGTGACGTCATGCGGATGTGTGG-3′，固定鏈序列為5′-GTAGCGCTCCCTGTTGTTGGTGACC-（CH）3-SH-3′，探針鏈序列為5′-SH-（CH）6-CCACACATCCGCATGACGTCACATTGAC-3′由上海生工生物工程股份有限公司合成，Tris-EDTA 緩沖液，四氧化三鐵磁性納米微球（-NH，5 mg·mL-1），6-巰基-1-己醇（MCH，98%），三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP，98%），均購自百塞生物，過氧化物酶購自阿拉丁，實驗所需其他分析純級化學(xué)品和試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，樣本來源于舟山市市場在售貝類。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600 紫外可見光分光光度計（日本島津企業(yè)管理有限公司）；MS-3 渦旋振蕩器（德國IKA 公司）；UVR 超純水機（法國Millipore 公司）；電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-600DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；離心機Centrifuge 5920R 型（德國Eppendorf 公司）；萬用電熱器（嘉興市鳳橋電熱器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別吸取一定體積的大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇制備成1.0 μg·mL-1和100 ng·mL-1濃度的大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲存于4 ℃以下避光。

吸取一定體積的鰭藻毒素-1 標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇制備成100 ng·mL-1濃度的鰭藻毒素-1 標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲存于4 ℃以下避光。

吸取一定體積的鰭藻毒素-2 標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇制備成100 ng·mL-1濃度的鰭藻毒素-2 標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲存于4 ℃以下避光。

1.3.2 樣品制備

該研究的社會經(jīng)濟數(shù)據(jù)來源為2005—2013年《山東省統(tǒng)計年鑒》。區(qū)域土地利用結(jié)構(gòu)的變化由自然因素和社會經(jīng)濟因素共同決定，由于研究期內(nèi)區(qū)域內(nèi)自然因素條件的變化很小，所以該研究主要考察社會經(jīng)濟因素指標(biāo)的影響，選擇了11項社會經(jīng)濟發(fā)展指標(biāo)[12-13]：總?cè)丝?X1)、人口密度(X2)、農(nóng)村人口(X3)、地區(qū)總產(chǎn)值(X4)、糧食總產(chǎn)量(X5)、城鎮(zhèn)居民人均可支配收入(X6)、第一產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值(X7)、第二產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值(X8)、第三產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值(X9)、人均GDP(X10)、固定資產(chǎn)總投資(X11)。

根據(jù)《GB 5009.212-2016 貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》對樣品進行制備。用清水洗凈貝類樣品外表，切斷閉殼肌，開殼，用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他異物，取出貝肉。不要破壞閉殼肌以外的組織，尤其是中腸腺（組織呈暗綠色或褐綠色）。將去殼貝肉置于篩網(wǎng)上，瀝水5 min，將貝肉剪碎。-20 ℃密封保存。

1.3.3 毒素提取

將處理后的試樣解凍后均質(zhì)，準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.1 g）于50 mL 帶蓋離心管中，加入9 mL 80%甲醇，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，8 000 r·min-1離心5 min，移出上清液于20 mL 刻度玻璃器皿中。殘渣中加入9 mL 80%甲醇，重復(fù)提取1 次，合并提取液，用80%甲醇定容至20 mL。

1.3.4 納米金制備

參考張萬方等[12]的方法進行適當(dāng)修改，具體如下：首先將需要使用的玻璃器皿在王水里面浸泡不少于12 h，用超純水清洗，干燥備用。將1 g 氯金酸溶解在100 mL 超純水中，配成1%（g/g）的氯金酸貯存液，儲存于避光4 ℃以下。取4.12 mL 的氯金酸貯存液加入100 mL 超純水溶液中攪拌加熱至沸騰。然后快速加入10 mL 1%（g/g）的檸檬酸三鈉溶液，發(fā)現(xiàn)溶液在5 min 內(nèi)由無色變成黑色再變成酒紅色。煮沸15 min 后，停止加熱，冷卻至室溫，并在4 ℃避光保存。

1.3.5 納米金標(biāo)記活化巰基探針鏈

參考DITTMER W U[13]和關(guān)樺楠[14]方法進行適當(dāng)結(jié)合修改，具體如下：取15 mL 的帶具塞離心管加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液里面浸泡1 h 后用純水沖洗干凈，干燥備用。將探針鏈1 000 r·min-1離心60 s 后，使用TE緩沖液配制成100 μmol·L-1的儲備液。取9 μL 濃度為1 μmol·L-1的巰基化的探針鏈加入1.5 mL 的離心管中，然后再加入10 μL 500 mmol·L-1醋酸鈉溶液（pH 5.2）和15 μL 10 mmol·L-1TCEP 溶液，室溫下孵育活化1 h，孵育結(jié)束后，將上述反應(yīng)液與5 mL 納米金溶液（用K2CO3調(diào)節(jié)pH 為9.0）加入被氫氧化鈉浸泡過的帶具塞離心管中，蓋上蓋子后輕輕搖勻，再加入10 μL 0.5 mg·mL-1HRP 室溫下避光孵育16 h。

1.3.6 制備納米金磁珠（AuMNPs）

取1 mL 5 mg·mL-1四氧化三鐵磁性納米微球，磁分離后去除上清液，用純水洗滌后加入3 mL 納米金溶液，避光保存8 h。

1.3.7 AuMNPs-Apt 的合成

先將固定鏈1 000 r·min-1離心60 s 后，使用TE 緩沖液配制成100 μmol·L-1的儲備液。再將100 μmol·L-1的儲備液稀釋成50 μmol·L-1。取9 μL 50 μmol·L-1固定鏈和10 μL 10 mmol·L-1TCEP，活化1 h。磁珠與納米金混合液離心后用純水重懸，加入活化后的固定鏈，4 ℃孵育過夜。加入500 μL 1 mmol·L-1MCH 30 min以封閉多余活性點位。用純水沖洗2～3 次，加入10 μL 1 μmol·L-1OA 適配體鏈，孵育8 h。

1.3.8 制備檢測OA 的比色適配體傳感器

取過量的含活化探針鏈的納米金溶液和200 μL AuMNPs 于1.5 mL 離心管孵育2 h。配制待測溶液，加入上述溶液混勻1 h。加入100 μL 顯色液（15% H2O2，2 mmol·L-1TMB，pH 4.0）混勻。等待10～15 min，測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

DNA 適配體能識別和靶向特異性分子并形成特異性三級結(jié)構(gòu)，DNA 適配體同時也能形成雙鏈結(jié)構(gòu)及其互補鏈，但適配體鏈與靶分子間的結(jié)合作用大于雙鏈DNA，因此，由于它處于互補的雙鏈核酸適配體中，并且處于靶分子環(huán)境中，它們更有可能特異性地與靶分子結(jié)合，形成適配體靶分子的三級結(jié)構(gòu)。因此，利用這一特性，設(shè)計了一種夾心式DNA 適配體來檢測溶液中OA 的濃度。首先，通過Au-S 鍵將補充OA適體5 端的巰基修飾的固定鏈自組裝到磁珠上[15]。然后用MCH 阻斷多余活性位點，與適體鏈進行雜交。與OA 適配體鏈雜交后，加入一定濃度的HRP-金納米顆粒標(biāo)記的探針鏈，與OA 適配體鏈的3 端結(jié)合，因此，形成了具有HRP 納米金標(biāo)記的適體傳感器。探針鏈能夠特異性識別OA 分子，適配體鏈與OA 結(jié)合并在磁性作用下分離。溶液中存在HRP 酶，HRP 對TMB-H2O2混合溶液發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化[16]。

2.2 實驗條件優(yōu)化

2.2.1 核酸適配體濃度的優(yōu)化

適配體含量對檢測結(jié)果有顯著影響。當(dāng)適體含量過低時，它不能與納米金膠體溶液完全連接。因此，不管目標(biāo)物是否存在，納米金膠體溶液在鹽溶液的作用下都會聚集變色，導(dǎo)致假陽性結(jié)果[17]。適體的含量太高時，溶液中的游離適體首先與靶目標(biāo)完全結(jié)合，使得吸附在金納米孔膠體溶液表面的適體不能完全解吸，導(dǎo)致納米金膠體溶液的分離受到適體的保護，導(dǎo)致假陰性結(jié)果[18]。因此，需要優(yōu)化適體的濃度。

分別取50 μL 不同濃度的核酸適配體溶液，濃度分別為0.1、1、10 和100 μmol·L-1。進行1.3.5～1.3.8 步驟實驗進行，最后，分別掃描400～800 nm 波長范圍內(nèi)的吸收光譜，重復(fù)3 次，結(jié)果如圖1。隨著適體含量的增加，AuNPs 溶液在520 nm 波長處的吸光度值逐漸增大，而在650 nm 波長處吸光度值逐漸減小。結(jié)果表明，隨著適體濃度的增加AuNPs 的聚集被逐漸抑制。因此，最佳的適體濃度為1.0 μmol·L-1AuNPs。

圖1 核酸適配體溶液對吸光度的影響（n=3）Fig.1 Influence of aptamer solution on absorbance（n=3）

2.2.2 HRP 濃度的優(yōu)化

HRP 對TMB-H2O2混合溶液會產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)變色，而HRP 的濃度會對變色反應(yīng)產(chǎn)生影響[19]。保持其他條件不變，只改變HRP 濃度進行實驗。如圖2，可得HRP 的濃度對整體的顯色反應(yīng)影響不大，通過吸光度來看0.5 mg·mL-1的HRP 對顯色效果較好。如圖3，隨著HRP 的濃度增大，反應(yīng)時間縮短，但濃度過大會抑制反應(yīng)速率，從而增加反應(yīng)時間。因此，選擇0.5 mg·mL-1為最佳的HRP 濃度。

圖2 HRP 的濃度對吸光度的影響Fig.2 Influence of HRP concentration on absorbance

圖3 HRP 的濃度對反應(yīng)時間的影響（n=3）Fig.3 Influence of HRP concentration on reaction time（n=3）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶劑曲線

在最佳條件下，采用610 nm 和520 nm 之間的吸收比（A610/A520）來確定OA 濃度。配置不同濃度的OA 溶液（0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 和100 ng·mL-1），加入制備好的比色生物傳感器，再加入顯色液，進紫外分光光度計檢測。見圖4，5 顯示了不同OA 濃度的生物傳感器的吸附光譜和顏色變化，隨著OA 濃度的增加，觀察到傳感器的明顯分散現(xiàn)象，610 nm 處的吸光值（表示聚集的AuNP）和520 nm 處的吸光度增加（表示分散的AuNP）。圖6 表示OA 濃度在0～10 ng·mL-1范圍內(nèi)吸光度比（A610/A520）可以看出0.2～2.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，圖7 表示在0.2～2.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系R2=0.995 8。根據(jù)分光光度法檢出限計算，算得檢出限（LOD）為0.045 ng·mL-1。

圖4 不同濃度OA 溶液的吸收光譜圖Fig.4 Absorption spectra of OA solutions with different concentrations

圖5 不同濃度OA 溶液的顏色Fig.5 Colors of OA solutions with different concentrations

圖6 OA 濃度在0 到10 ng·mL-1 范圍內(nèi)吸光度比（A610/A520）Fig.6 Absorbance ratio of OA concentration in the range of 0 to 10 ng·mL-1（A610/A520）

圖7 OA 濃度在0.2 到2.0 ng·mL-1 范圍內(nèi)吸光度比（A610/A520）Fig.7 Absorbance ratio of OA concentration in the range of 0.2 to 2.0 ng·mL-1（A610/A520）

2.4 傳感器分析性能

根據(jù)2.3 在最佳條件下，采用吸光度比值（A610/A520）來確定OA 濃度。用陰性的貽貝基質(zhì)配置不同濃度的OA 溶液（0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10 和20 ng·mL-1），加入制備好的比色生物傳感器，再加入顯色液，進行紫外分光光度計檢測。圖8 表示在0.2～2.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系R2=0.998 9。根據(jù)分光光度法進行檢出限計算，算得檢出限（LOD）為0.044 ng·mL-1。從圖8 可以得出基質(zhì)效應(yīng)對本方法的OA 影響較小。

圖8 OA 濃度在0.2 到2.0 ng·mL-1 范圍內(nèi)吸光度比（A610/A520）Fig.8 Absorbance ratio of OA concentration in the range of 0.1 to 2.0 ng·mL-1（A610/A520）

為了進一步檢驗檢測實際樣品中OA 的新方法的可行性，選取3 種陰性的貝類樣本進行加標(biāo)回收，設(shè)置（0.5、1.0、2.0 ng·mL-1）3 個濃度，每個濃度3 個平行，按照最佳的試驗方案進行，計算回收率，如表1，平均回收率為82.23%～98.73%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為3.34%～10.88%，表明本方法有較好回收率和精密度。

表1 樣品加標(biāo)回收率試驗結(jié)果（n=3）Tab.1 Sample spiked recovery test results（n=3）

2.5 特異性研究

OA 與其衍生物鰭藻毒素DTX-1 和DTX-2 的分子結(jié)構(gòu)非常相似，分別配制濃度為10 ng·mL-1的DTX-1 和DTX-2 進行測試，以考察傳感器的特異性。結(jié)果如圖9 表明，研制的傳感器對OA 具有高度特異性，對DTX-1 和DTX-2 的吸光度接近納米金的測試背景值，表明此傳感器能夠?qū)Ｒ恍宰R別OA，其衍生物毒素的存在不干擾OA 的檢測。

圖9 核酸適配體傳感器對不同貝類毒素和納米金溶液的吸光度比（A610/A520）Fig.9 Absorbance ratio of nucleic acid aptamer sensor to different shellfish toxin and nano-gold solution（A610/A520）

2.6 實際樣品檢測結(jié)果

采用自制的比色型適配體生物傳感器對市售的4 種貝類樣品測定，結(jié)果見表2。10 個實際樣品中，除9、10 號盲樣外均未檢出。

表2 實際樣品檢測Tab.2 Actual sample detection

3 總結(jié)

本次研究開發(fā)了一種用于檢測大田軟海綿酸的快速且靈敏的比色適配體生物傳感器。在0.2～2.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9，檢測限為0.044 ng·mL-1。在對實際樣品的檢測中平均回收率在82.23%～98.73%之間，表明該方法具有較好的回收率。適配體的特異性識別與顯色反應(yīng)體系保證了生物傳感器檢測OA 有良好選擇性和準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，該方法快速、方便、靈敏，為OA 的快速現(xiàn)場檢測提供了新思路。